结肠癌患者区域淋巴结高IL-10 mRNA水平预示不良预后：一项长达12年随访的分子预后研究

本研究发现结肠癌（CC）患者区域淋巴结（LNs）中高IL-10 mRNA水平与不良预后显著相关（风险比HR=12.4，p=0.001），而FoxP3 mRNA高表达则提示较好预后。研究通过qRT-PCR绝对定量和免疫组化分析，证实IL-10与LGR6或CXCL17联合可进一步区分复发风险层级，为术后个体化治疗（如豁免辅助化疗或强化干预）提供分子依据。

　　

引言

结肠癌（Colon Cancer, CC）是全球癌症死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率在某些国家因结肠镜筛查和治疗改进而下降，但仍居全球发病率第三和死亡率第二位。手术是主要治疗手段，常辅以化疗、抗血管生成治疗和免疫治疗。免疫系统在防御肿瘤发展中起重要作用，涉及适应性免疫和先天免疫的效应细胞，如αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。细胞毒性CD8⁺T细胞尤其重要，而调节性T细胞（Tregs）则通过表达转录因子FoxP3和细胞因子IL-10维持免疫稳态和自我耐受。肿瘤可能通过表达抑制因子或过度激活Tregs释放IL-10等机制来逃避免疫监视。

IL-10是II类细胞因子家族成员，其生物活性形式为36 kDa同源二聚体，需与异四聚体IL-10受体（IL-10R）结合发挥作用。IL-10的主要细胞来源包括T细胞（如Tregs和TR1细胞）、B细胞和单核/巨噬细胞。在结直肠癌（CRC）中，IL-10在肠道稳态中起核心作用，缺乏IL-10的小鼠会自发发生结肠炎。IL-10的功能多样，既可抑制炎症和生长促进细胞因子的合成，也能促进抗炎因子分泌并调节免疫细胞分化和增殖，因此其促瘤或抑瘤作用取决于肿瘤类型和发展阶段。

FoxP3是Tregs的功能必需因子和标志性标记，通过产生IL-10和TGF-β实现免疫抑制。CRC原发肿瘤和引流淋巴结（LNs）中Tregs数量显著高于正常组织，且转移性LNs中Tregs更多。然而，FoxP3作为预后标志物的价值仍存争议。本研究通过mRNA分析探讨IL-10和FoxP3在CC患者所有TNM分期LNs中的表达水平，并与术后12年复发情况关联，旨在评估其预后价值。

材料与方法

研究主要目标是通过实时qRT-PCR绝对定量IL-10和FoxP3 mRNA在370个LNs（来自120例CC患者，涵盖所有TNM分期）、66个原发肿瘤、30个正常结肠组织和细胞系中的表达。次要目标是评估这些标志物的预后价值，使用Kaplan-Meier生存模型和Cox回归分析，并探讨IL-10与LGR6或CXCL17联合的预后意义。

患者来自瑞典两家医院，纳入标准为意向治愈性手术且无其他癌症（除外非黑色素瘤皮肤癌）。LNs由外科医生术中分半，一半用于常规病理学检查（pN分类），另一半速冻用于RNA提取。基于组织病理学，20个LNs为转移性[H&E(+)]，350个为非转移性[H&E(–)]。对照LNs来自13例非癌症患者。免疫组化分析13个LNs、10个原发肿瘤和9个正常结肠组织。

qRT-PCR采用定制引物和探针，以及RNA拷贝标准进行绝对定量，检测IL-10（转录变体NM_000572.3和NM_001382624.1）和FoxP3（NM_014009.4和NM_001114377.2）mRNA。表达水平以mRNA拷贝/18S rRNA单位表示。免疫组化使用抗IL-10、抗FoxP3和抗CEA单克隆抗体，DAB显色。统计分析采用Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis ANOVA、Spearman相关检验、Kaplan-Meier和Cox回归分析，p≤0.05视为显著。

结果

原发肿瘤和细胞系分析

IL-10 mRNA在原发肿瘤中略高于正常结肠组织（中位数0.002 vs. 0.0015拷贝/18S rRNA单位），而FoxP3 mRNA差异更大（0.13 vs. 0.001拷贝/单位），因多数正常样本无FoxP3表达。5个CC细胞系均不表达IL-10，但Jurkat T细胞系高表达IL-10，CNB6 B细胞系低表达。FoxP3在T细胞系高表达，在CC细胞系和成纤维细胞系低表达。免疫组化显示IL-10和FoxP3蛋白在肿瘤细胞聚集体外围表达，正常结肠组织无染色，表明这些标志物由肿瘤微环境细胞表达。

生存分析显示，原发肿瘤高IL-10 mRNA与预后无显著关联，而高FoxP3 mRNA预示较好预后（5年随访生存差8个月，p=0.01，HR=0.32）。

淋巴结分析

IL-10 mRNA在LNs中的表达与TNM分期、H&E状态和CEA水平显著相关：III期患者LNs水平高于I和II期；H&E(+) LNs高于H&E(–)和对照LNs；CEA(+) LNs高于CEA(–)或中间水平LNs。FoxP3 mRNA无此变化。免疫组化证实IL-10和FoxP3阳性细胞位于CEA+肿瘤细胞聚集体附近，H&E(–) LNs中仅有零星阳性细胞。

预后分析表明，LNs高IL-10 mRNA预示不良预后：IL-10(+)患者5年随访平均生存短10个月（p=0.001），12年短32个月（p=0.004），风险比分别为12.4和6.3。低IL-10 mRNA患者复发风险极低（30例中仅2例复发）。FoxP3 mRNA高表达组预后稍好，但差异小且临床意义有限。IL-10与LGR6或CXCL17联合可将IL-10(+)患者进一步分为高风险和极高风险组：LGR6高风险组27例，5年生存差10个月（p=0.01，HR=2.4）；CXCL17联合类似。相关性分析显示IL-10与LGR6和CXCL17 mRNA水平良好相关，与FoxP3相关性弱。

讨论

本研究支持区域LNs中IL-10表达细胞促进肿瘤生长的观点。高IL-10 mRNA水平预示不良生存，低水平指示极低复发风险。这种促瘤作用在原发肿瘤中未观察到，可能源于IL-10在不同微环境中的双重角色或与不同细胞互作的差异。

免疫组化提示IL-10产生细胞属于微环境细胞（如Tregs），而非肿瘤细胞本身（CC细胞系不表达IL-10）。动物模型表明Tregs来源的IL-10可通过激活单核细胞上调PD-L1，抑制CTLs的颗粒酶B产生，从而促进转移。标志物组合（如IL-10+LGR6或CXCL17）能进一步区分风险层级，指导个体化治疗：低风险患者或可豁免辅助治疗，极高风险者需强化干预。

FoxP3 mRNA预后价值有限，因其表达也见于非Tregs细胞（如成纤维细胞）。mRNA定量qRT-PCR因高灵敏度、特异性和适合临床自动化而被推崇，优于RNA-seq或蛋白分析，但无法检测翻译后修饰。液体活检中蛋白分析可能更优因mRNA标准化方法缺乏。

研究局限性包括样本量较小（120例）和斯堪的纳维亚人群为主，需前瞻性研究验证。

结论

区域LNs中IL-10 mRNA水平是CC患者术后预后预测的有用工具。低水平标识无需进一步治疗的患者，而IL-10与LGR6或CXCL17联合可识别极高复发风险患者。