解码海沃德猕猴桃基因组：干旱与盐胁迫下的转录组响应及AdhSAP4在盐胁迫应答中的负调控作用

本研究通过构建海沃德猕猴桃高质量单倍型参考基因组，系统解析了其在干旱（20% PEG-6000）和盐胁迫（200 mM NaCl）下的转录组动态，发现AdhSAP4通过核定位负调控盐胁迫耐受性，为多年生作物抗逆育种提供了新靶点。

引言

植物作为固着生物必须适应环境变化才能生存。当前全球变暖背景下气候多变给作物带来巨大压力，导致产量和品质下降，威胁粮食安全。在影响作物品质和产量的非生物胁迫中，盐度和缺水最为突出。目前美国62%的耕地受干旱影响，10%受盐害影响。干旱和盐胁迫显著降低植物生长发育，中等或严重干旱下土壤中盐分和离子积累引起渗透胁迫和离子毒性。干旱胁迫增加会降低植物细胞膨压，使细胞壁起皱松弛，减少叶片大小和数量、鲜重及含水量，影响大多数农艺相关作物。这两种胁迫还影响养分吸收，引起渗透和离子胁迫导致氧化胁迫，降低光合作用和产量。植物已进化出多种细胞和分子机制应对这些不利环境因素。

材料与方法

本研究使用本氏烟（栽培种Xanthi NN）和T1代p35S:AdhSAP4-GFP转基因株系，在温室玻璃棉中培养，采用标准水培培养基灌溉。海沃德猕猴桃植株由Viverosur公司赠送。猕猴桃节间外植体经表面消毒后置于固体1/2 MS培养基（含0.5 mg/L BAP）中进行离体再生，每月继代培养直至芽再生。植株在24°C、16小时光周期下培养，白光荧光照明（150 μmol m^?2 s^?1，22–25°C）。

两个月大离体未生根猕猴桃植株在含200 mM NaCl（盐处理）的固体MS培养基中生长。转录组分析中，三株植株叶片混合进行RNA提取，在实验开始（CT0）、6小时（ST1）和24小时（ST2）取三个重复样本。干旱处理中，未生根枝条置于含20% PEG-6000的液体MS培养基中，仅浸没茎部。样本在CT0、6小时（DT1）和24小时（DT2）采集。

DNA提取采用Doyle（1991）方法改进方案。Illumina基因组测序使用Truseq Nano DNA LT文库制备试剂盒，PacBio全基因组测序使用SMRTbell prep kit 3.0。RNA提取按Chang等（1993）方法改进，RNA文库用TruSeq Stranded mRNA样本制备试剂盒构建，在Illumina HiSeq上进行150循环双端测序。

海沃德猕猴桃参考基因组组装使用MaSuRCA v4.0.9软件，重复元件用RepeatModeler v2.0.4检测并用Repeatmasker v.4.1.5屏蔽。基因预测使用MAKER v3.01.3，基因注释用InterproScan v5.62-94.0和eggNOG-mapper v2.1.9完成。直系同源群鉴定使用OrthoVenn3平台，系统发育树用FastTree2生成。SAP同源基因系统发育树通过Mafft v7.511多序列比对和IQ-TREE v1.6.12构建。

差异表达分析使用STAR v2.7.10将测序读数与参考基因组比对，用Rsubread包分配表达值，edgeR包进行差异分析。RT-qPCR验证使用相同RNA样本，用ImProm-II?逆转录酶合成cDNA，在Agilent Stratagene Mx3000p仪器上进行。载体构建中，AdhSAP4 cDNA通过RT-PCR获得，克隆到pCR?8/GW/TOPO载体，再重组到pGWB5载体生成p35S:AdhSAP4-GFP二元载体。亚细胞定位通过农杆菌浸润本氏烟叶片瞬时表达AdhSAP4-GFP观察。烟草稳定转化采用农杆菌介导法，外植体在含抗生素培养基中筛选。

结果

海沃德参考基因组

从PacBio和Illumina测序数据组装得到567.6 Mbp单倍体基因组，BUSCO完整性96.2%。44.2%基因组为重复元件，主要为LTR Copia和Ty3-反转录转座子（分别占基因组8.91%和8.62%），Hobo-Activator DNA转座子占3.92%。Maker注释流程鉴定出42,797个蛋白编码基因（AED < 0.75），94.75%通过同源性赋予功能。

比较基因组学分析显示海沃德猕猴桃与中华猕猴桃支系分化时间不足1100万年，相比最近共同祖先扩张了387个直系同源基因簇，收缩了706个。从直系同源簇中鉴定出7个SAP蛋白家族，共56个基因，其中40个对应中华猕猴桃和海沃德猕猴桃品种。

转录组分析

RNA测序平均获得46,945,521条读数，QC>30.0的占93.6%，89.7%总读数正确比对参考基因组。差异表达分析鉴定出10,459个DEG（FDR < 0.01）。干旱胁迫6小时和24小时分别鉴定出2,200和2,937个DEG，盐胁迫6小时和24小时分别鉴定出4,970和1,332个DEG。维恩图显示两种胁迫处理共有582个共同DEG。干旱胁迫中24小时特有DEG（729个）多于6小时（155个），盐胁迫中6小时特有DEG（1,883个）远多于24小时（93个），表明猕猴桃叶片对盐胁迫响应更快，24小时后开始恢复正常。

基因本体分析显示，上调DEG中，两种胁迫均显著富集茉莉酸、有机羟基化合物和毒素代谢过程、水杨酸和乙烯响应、脂肪酸和冷响应、叶片衰老、信号调控和有机酸分解代谢过程。缺氧和氧含量降低相关GO术语在干旱胁迫中T2晚期出现，而在盐胁迫中T1和T2均强富集。下调DEG中，光合作用、质体组织和叶绿素代谢过程在干旱胁迫T1和T2均突出，盐胁迫中仅T1富集。胚胎后植物形态发生、细胞多糖代谢过程和碳水化合物生物合成过程在盐胁迫T1和干旱胁迫T2富集，表明胁迫响应存在时间差异。

胁迫响应调控候选基因鉴定

共142个候选基因与两种胁迫响应正相关，包括乙烯响应转录因子（ERF1B、ERF4、ERF10和RAP2-1）、NAC结构域蛋白（NAP1、NAC002、NAC021、NAC025和NAC083）、WRKY DNA结合蛋白（WRKY7和WRKY45）和A20/AN1结构域胁迫相关蛋白（SAP1和SAP4.1）。176个下调候选基因中包含碱性螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白（bHLH19和bHLH25）、MYB转录因子MYB16、两个TCP14转录因子以及与ABA（NCED4）和细胞分裂素（CKX7）调控相关的两个候选基因。

猕猴桃SAP鉴定及胁迫下表达

SAPs在植物胁迫响应中起重要作用。海沃德品种SAP成员鉴定显示其分布与其他物种相似（通常10-20个成员）。系统发育分析将93个蛋白（包括水稻和拟南芥SAPs）分为5个主要分支，AdhSAP4.1与水稻OsiSAP7（LOC_Os12g42400）氨基酸同一性高，后者是已知的SAP蛋白家族成员和 abiotic胁迫响应负调控因子。因此选择AdhSAP4进行功能表征。

AdhSAP4亚细胞定位及烟草过表达

SAP蛋白通常定位于细胞核。瞬时表达AdhSAP4-GFP在本氏烟叶片中与胡萝卜转录因子DcAlfin4-RFP共定位于细胞核，表明AdhSAP4具有核定位。为评估AdhSAP4在胁迫响应中的正负调控作用，在本氏烟中稳定过表达AdhSAP4。T0代转基因植株生成并筛选，T1代幼苗用于功能和分子 assay。五个T1株系中L2、L3和L4的AdhSAP4相对表达量高于WT。盐胁迫敏感性评估中，12天大的T1幼苗转移至含0、100、150和200 mM NaCl的MS平板培养三周。第三周时，WT植株在0、100和150 mM NaCl下叶面积相似，200 mM NaCl下生长显著减少。转基因株系即使在0 mM NaCl下叶面积也小于WT，可能与过表达AdhSAP4的代谢效应有关。100 mM NaCl下T1和WT植株叶面积与0 mM NaCl对照相似，仅L3在0和100 mM NaCl间叶面积显著减少。150和200 mM处理下，生长严重减少和叶片 chlorosis明显，转基因T1株系不仅与WT在各盐胁迫条件下差异显著，叶面积也从100 mM的30–75 mm2剧减至150 mM的不足30 mm2或200 mM的20 mm2。根部发育类似减少，该效应似乎与 transgene表达水平无关，表明AdhSAP4负向影响盐胁迫下的植物胁迫响应。

长期盐暴露降低转基因烟草叶绿素含量

盐胁迫引起植物生长和代谢多种缺陷。暴露于盐胁迫会触发活性氧（ROS）爆发，导致叶绿素降解。测定灌溉200 mM NaCl四周的两个月大AdhSAP4株系叶绿素含量。第四周处理结束时，测量第三和第四叶（自下而上计数，平均每株6叶）叶绿素。选择两类叶片因胁迫症状常随叶位变化。AdhSAP4株系第三叶明显受胁迫，叶小且 chlorosis，第三叶叶绿素含量显著降低，第四叶更甚。表明AdSAP4是赋予盐胁迫敏感性的负调控因子，降低叶绿素水平。

讨论

海沃德基因组组装

多数猕猴桃属测序基因组属于中华猕猴桃种，本研究首次呈现海沃德猕猴桃单倍体基因组组装。多倍体在植物基因组进化中重要作用，增加对极端环境适应可塑性和重复基因叠加效应。多倍体还可导致转录组和调控机制大规模重组，可能由转录因子、小RNA等调控元件数量不平衡触发，从单基因表达到整个调控模块网络改变。最近研究表明海沃德猕猴桃六倍体基因组大部分与二倍体中华猕猴桃比对，95.5%同源基因对相似性超过90%。但基因组内和间比较显示染色体修饰，表明若为自多倍体，染色体重排发生在自动六倍化后。注释水平上，海沃德单倍体基因组完整性高（96.2% BUSCO），注释蛋白数量与其他猕猴桃相似，分化时间超过1000万年。SAPs直系同源群未见基因家族扩张或收缩，可能因物种遗传亲近和当前组装基于单倍体版本，未能体现全基因组复制导致的拷贝多样性。根据A20和AN1结构域N或C末端存在，13个猕猴桃AdhSAPs可分为5簇（I至V组）。A20结构域C末端含七个特征性Cys2/Cys2锌指，保守域为CX_2-4CX₁₁CX₂C。AN1结构域最初在非洲爪蟾卵和早期胚胎中作为泛素样融合蛋白发现。尽管动物系统中部分A20/AN1锌指蛋白功能与免疫响应调控相关，其在植物中作用尚未完全阐明。海沃德猕猴桃各SAP与拟南芥或水稻SAPs系统发育关联，可分类可能功能，V簇蛋白结构域最多样，所有该簇海沃德SAPs鉴定为OsSAP4和OsSAP8同源物。水稻OsiSAP7表征为 abiotic胁迫负调控因子，过表达导致盐胁迫敏感性。OsiSAP7在海沃德猕猴桃最近同源物为Adh_00052715基因，鉴定为AdHSAP4，均位于II簇，支持表征AdHSAP4在盐胁迫中作用的兴趣。

海沃德盐和干旱胁迫差异表达分析

差异表达分析鉴定出318个候选基因（CG）表达模式与两种胁迫响应高度相关。ROS响应相关基因显著富集（如两种胁迫GO分析所示）。氧化还原稳态通过抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧还蛋白（PRX）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）降低ROS水平，主动去除过量ROS保护植物细胞免受氧化损伤。此意义上，318个CG中142个与两种胁迫和测量时间正相关，包括四个细胞色素P450家族蛋白（AcDH_00048223、AcDH_00014316、AcDH_00084161和AcDH_00032701）和一个描述为棉子糖合酶家族蛋白DIN10的基因（AcDH_00046123）。细胞色素酶发挥多种作用，包括激素、脂肪酸、甾醇、细胞壁组分生物聚合物和防御相关化合物如萜类和黄酮类代谢。大豆中一个P450家族成员参与茉莉酸和乙烯信号通路 abiotic胁迫响应，甜橙中该家族成员参与抗氧化黄酮代谢，通过增强ROS清除活性促进耐旱性。DIN10参与棉子糖合成，关联渗透调节以避免ROS通过合成棉子糖作为渗透剂引起氧化损伤。所有这些基因突出两种胁迫下的氧化场景。另一方面，多聚泛素基因已知通过泛素蛋白酶体系统（UPS）参与蛋白周转。这与胁迫相关蛋白如SAP5（AcDH_00049822）相同，后者在干旱胁迫处理表达最高层级，已知在拟南芥中作为胁迫正调控因子具有E3泛素连接酶活性。

AdhSAP4赋予本氏烟盐胁迫敏感性

A20/AN1蛋白是复杂调控网络部分，因其可被受体样胞质激酶磷酸化激活，植物严重依赖UPS等调控机制维持细胞稳态和持续生长。UPS用于调控蛋白功能，产生细胞变化响应环境变化和减轻胁迫负面影响。近期研究表明SAPs贡献于多种细胞过程，如耐旱、渗透胁迫、保水、耐盐和温度调控。其功能多样性引人入胜，尤其作为泛素连接酶、氧化还原传感器和基因表达调控因子。部分SAPs还能易位入核并结合胁迫响应基因顺式作用元件，增加其作用复杂性。此范围细胞功能使精确定位许多SAPs确切作用具挑战性。SAP蛋白互作特定伙伴仍未知，SAP蛋白自身互作可能性亦存。此外，部分SAP蛋白观察到易位入核并结合胁迫响应基因顺式作用元件，但其在基因表达中确切作用仍未知。考虑此信息，选择AdhSAP4破译其作为植物盐胁迫正负调控因子潜在作用。本氏烟AdhSAP4过表达株系显示盐胁迫敏感性和叶绿素含量降低。此负面效应仅少数A20/AN1蛋白如AdHSAP4最近同源物OsiSAP7中描述。具体地，Sharma等（2015）评估OsiSAP7发现证据支持OsiSAP7作为ABA和水分亏缺胁迫信号负调控因子具E3连接酶活性。OsiSAP7过表达关联负调控作用，表现为过表达植株叶绿素含量降低。机制上，OsiSAP7过表达增加植物对活性氧超敏性，此状况 predisposes叶绿体氧化损伤和后续叶绿素分子降解。此ROS超敏性归因于ROS解毒机制失衡；例如，不同于正调控SAPs如OsSAP1和OsSAP8上调抗氧化酶如CAT、SOD和POD，OsiSAP7过表达可能未能充分诱导此类保护响应，从而使ROS水平不受控上升。因此，此条件下发生氧化损伤导致叶绿素更快速降解，损害光合机构。类似地，李属PpSAP1和水稻ZPF185过表达产生较小叶片尺寸和增加对 abiotic胁迫敏感性，类似本氏烟过表达AdhSAP4观察结果，支持SAP蛋白在胁迫和发育过程中双重作用意外多样。因此，结果表明AdHSAP4亦是负调控因子，可进一步研究作为通过基因编辑改良海沃德猕猴桃作物候选。

结论

本研究通过整合PacBio和Illumina测序获得高质量海沃德猕猴桃组装和注释，相比先前中华猕猴桃基因组版本改善基因数量和覆盖度。高盐和干旱条件下猕猴桃叶片RNA测序揭示其管理胁迫条件响应一瞥，每种情况不同响应集。基因本体分析显示，植物激素对干旱和盐胁迫响应相似，突出其海沃德关键调控作用。茉莉酸、有机羟基化合物、毒素代谢过程、水杨酸和乙烯响应、脂肪酸和冷响应均两种胁迫条件显著富集，表明这些通路对应激响应关键。转录组分析观察总和表明，尽管两种胁迫引发类似初始响应涉及植物激素和代谢过程调整，特定响应如缺氧和光合作用时机和持续时间猕猴桃中干旱和盐胁迫间变化，表明海沃德植株管理不同环境胁迫复杂动态适应机制。

最后，A20/AN1蛋白AdhSAP4定位于细胞核尽管缺乏典型核转运信号。而且，AdhSAP4过表达增加盐胁迫敏感性，损害叶片尺寸和降低本氏烟叶绿素含量，突出AdhSAP4作为海沃德猕猴桃盐胁迫耐受性负调控因子。