靶向小鼠PD-1激动型抗体的鉴定及其在T细胞活化抑制中的作用与机制研究

本综述系统评估了多种抗小鼠PD-1单克隆抗体的功能特性，发现RMP1–30具备显著激动活性（不阻断PD-1/PD-L1结合），而RMP1–14则表现出独特的双重功能（兼具阻断与激动效应）。研究强调PD-1表达水平与Fc受体（FcγRIIB）介导的交联是调控抗体功能的关键因素，为PD-1靶向治疗在自身免疫病和肿瘤免疫中的应用提供了重要理论依据。

　　

引言

程序性死亡受体-1（PD-1）作为关键的免疫抑制分子，通过与其配体PD-L1结合抑制T细胞、NK细胞和B细胞的活性，在维持免疫稳态中发挥重要作用。PD-1阻断抗体在肿瘤免疫治疗中已取得显著成功，但近年来研究发现，PD-1激动剂可能成为治疗自身免疫性疾病的新型免疫抑制剂。然而，针对小鼠PD-1（mPD-1）的激动型抗体一直缺乏，限制了其在多种疾病模型中的疗效验证。本研究通过评估商业化的抗mPD-1单克隆抗体，发现了具有激动活性的抗体克隆，并深入探讨了其作用机制和功能特性。

材料与方法

研究采用DO11.10 T细胞杂交瘤和IIA1.6 B淋巴瘤细胞系，通过逆转录病毒转导技术构建了表达不同水平mPD-1的细胞系（mPD-1^high和mPD-1^int）。抗体克隆包括RMP1-30（rat IgG2b）、29F.1A12（rat IgG2a）、RMP1-14（rat IgG2a）和J43（hamster IgG）。阻断活性通过检测抗体逆转PD-L1介导的IL-2抑制来评估，而激动活性则通过抗体在FcγRIIB⁺ PD-L1^-细胞存在下抑制IL-2产生的能力来测定。竞争性结合实验使用mPD-L1-Fc融合蛋白分析抗体对PD-1/PD-L1结合的干扰。此外，研究还利用DO11.10转基因小鼠的原代CD4⁺ T细胞验证抗体在生理条件下的功能。

结果

阻断活性分析

在评估的四种抗体中，29F.1A12表现出最强的阻断活性，能显著逆转PD-L1介导的IL-2抑制，尤其在PD-1^int细胞中效果更为明显。RMP1-14和J43具有中等阻断活性，而RMP1-30则无任何阻断作用。竞争性结合实验进一步证实，29F.1A12能完全抑制PD-L1-Fc与PD-1的结合，RMP1-14和J43需较高浓度才能部分抑制，而RMP1-30不影响PD-L1结合。

激动活性分析

在FcγRIIB⁺ PD-L1^-的IIA1.6细胞存在下，RMP1-30和RMP1-14表现出显著的激动活性，能剂量依赖性地抑制IL-2产生，且在PD-1^high细胞中效果更为突出。29F.1A12仅显示微弱的激动效应，而J43无此活性。原代T细胞实验表明，RMP1-30在生理PD-1表达水平下仍具有激动活性，而RMP1-14主要表现为阻断功能。

PD-1表达水平对功能的影响

研究发现PD-1表达水平显著影响抗体的功能表现。高表达PD-1的细胞对激动剂更为敏感，而低表达细胞则更容易检测到阻断活性。RMP1-14在PD-1^high细胞中表现为激动剂，而在PD-1^int细胞和原代T细胞中则主要发挥阻断作用，表明其功能具有上下文依赖性。

结合位点与机制

通过构建mPD-1(hu_38-48)嵌合体，发现RMP1-14的激动活性依赖于对mPD-1膜近端_38-48段的识别，而RMP1-30则结合其他表位。Fc受体交联是激动活性不可或缺的条件，阻断FcγRIIB或使用Fc受体缺陷细胞均 abolished RMP1-30和RMP1-14的激动效应。

讨论

本研究首次鉴定出RMP1-30作为mPD-1的激动型抗体，其功能依赖于FcγRIIB介导的交联和PD-1膜近端表位的识别。RMP1-14的双重功能特性揭示了PD-1表达水平和局部微环境对抗体功能的调控作用。这些发现不仅为PD-1靶向治疗在自身免疫病中的应用提供了工具抗体，也提示临床使用的PD-1阻断抗体（如nivolumab和pembrolizumab）可能在某些条件下表现出激动活性，影响治疗效果。未来研究需通过Fc工程化优化抗体功能，并在多种疾病模型中验证其疗效。

结论

RMP1-30是首个具有明确激动活性的抗mPD-1抗体，适用于小鼠疾病模型的研究。RMP1-14的双重功能特性使其在肿瘤模型中主要表现为阻断剂，但在特定条件下可能发挥激动效应。这些发现深化了对PD-1抗体功能多样性的理解，为开发新型免疫调节剂提供了重要依据。