利用废弃源挥发性脂肪酸构建固氮微生物组：迈向循环与韧性的生物肥料新策略

本研究通过微生物组工程（ME）策略，利用动物废弃物衍生的挥发性脂肪酸（VFAs）作为唯一碳源，成功构建了一种自组装固氮微生物群落（SANF）。该群落以Sinirhodobacter spp.、Aureimonas spp.和Taibaiella spp.为优势菌，固氮效率提升2.7倍，并可释放无机氮（如NH?，浓度达12.7 mg·L?1）。接种番茄后，Pseudomonas spp.和Exiguobacterium spp.成为优势菌并显著促进植株生长与产量，效果媲美合成氮肥。该研究为开发低成本、可持续的微生物肥料提供了新路径，并推动废弃物资源化与循环农业的发展。

　　

引言

合成氮肥的过度使用导致严重的环境问题，包括温室气体排放与水体富营养化。传统单一菌株生物肥料虽有一定效果，但常因适应性差、土壤竞争激烈而表现不稳定。微生物组工程（Microbiome Engineering, ME）作为一种新兴策略，通过构建自组装功能群落（Self-Assembled Nitrogen-Fixing Community, SANF），可克服单菌应用的局限性，提高功能冗余性与生态韧性。本研究以挥发性脂肪酸（VFAs）——一种源自动物废弃物厌氧发酵的廉价碳源——为基础，通过定向富集与选择，构建高效固氮微生物群落，并评估其作为生物肥料的潜力。

材料与方法

微生物接种物采集自哥伦比亚Valle del Cauca省一处未施用合成氮肥的家庭农场，取自木薯、大蕉、芦荟和臂形草的根际土壤。根系经NaCl（0.85%）与Tween 80（0.01%）溶液振荡清洗，离心过滤后获得混合菌悬液作为起始接种物。

微生物组工程包括富集与选择两阶段：

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  富集阶段：在500 mL生物反应器中，以无氮基础（NFB）培养基为底物，分别添加合成VFAs混合物（乙酸7.45 g/L、丙酸2.25 g/L、丁酸1.85 g/L）、葡萄糖-甘露醇（各8 g/L）或无碳源作为对照。通入过滤空气作为氮源与氧源，以7天为周期进行6次半连续培养，每次更换99%培养基。

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  选择阶段：将富集后的菌液进行10?3至10??梯度稀释，重新接种于NFB培养基中，在持续通气条件下培养28天。通过监测光密度（OD???）、pH、总氮与VFAs消耗，筛选出固氮效能最高的群落（V-6稀释度）。

随后，以猪粪衍生的VFAs混合物（含乙酸、丙酸、丁酸等）为碳源，进一步验证其固氮能力，并与合成VFAs及单一酸对比。

生物肥料潜力评估采用水培与土壤系统：

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  水培试验：以浮板系统培养番茄（品种UNAPAL-Maravilla），设5处理：接种微生物菌体（BIOM）、上清液（SPNT）、商业菌剂AZO（含Azotobacter chroococcum与Azospirillum sp.）、全营养Hoagland溶液（NITRO）及无氮对照（C-）。

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  温室试验：番茄幼苗种植于3 kg土壤中，设6处理（增加直接施用反应器 effluent 的EFLU组），定期测量株高、叶数、果实鲜重等农艺性状。

微生物群落分析通过16S rRNA基因测序（V3–V4区，引物341F/805R），使用QIIME2与SILVA 138数据库进行 taxonomic 注释，并通过Phyloseq进行可视化与多样性分析。

结果

富集与选择阶段显示，VFAs为碳源的群落虽初期生长较慢，但后期生物量反超葡萄糖-甘露醇组。pH在VFAs代谢中上升，而在糖类代谢中下降。选择阶段中，A-6反应器（10??稀释）表现出最高固氮能力（总氮显著高于初始接种物），且丁酸与丙酸消耗率最高。

以猪粪VFAs为碳源时，群落生长与固氮效能最佳，VFAs总消耗率超90%，且氮积累于稳定期达到峰值。培养液中检测到高达12.7 mg·L?1的无机氮释放。

接种番茄后：

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  水培系统中，BIOM处理促进植株生长（株高、叶数、叶绿素、鲜重、根长）与NITRO相当，显著优于C-与AZO处理。显微镜下可见BIOM处理根表有生物膜形成。

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  温室系统中，EFLU（直接施用 effluent）效果最佳，与NITRO无显著差异；BIOM虽优于C-，但不及NITRO。

微生物群落结构显示：

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  选择阶段优势菌为Sinirhodobacter spp.（44.4%）、Gordonia spp.与Gluconoacetobacter spp.。

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  以猪粪VFAs喂养后，Aureimonas spp.（17.7%）与Taibaiella spp.（12.4%）丰度上升。

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  接种番茄根际后，BIOM处理中Pseudomonas spp.（20.7%）、Exiguobacterium spp.（11.9%）与Sphingobium spp.（6.8%）显著富集，而Clostridium spp.等下降。

相关性分析表明，Sinirhodobacter与VFAs消耗正相关，Gordonia与氮积累正相关，暗示群落内存在代谢分工与协作。

讨论

本研究成功通过ME策略构建了以废弃物源VFAs为碳源的高效固氮群落。其优势在于：

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  功能聚合：尽管优势菌并非传统固氮菌（如Rhizobium），但它们在氮限制条件下表现出显著固氮与释氮能力，暗示群落水平的功能涌现与协同。

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  生态适应性：接种番茄后，群落能重构根际微生物组，招募有益菌（如Pseudomonas、Exiguobacterium），抑制潜在竞争者（如Clostridium），体现出良好的生态位适应性与功能可塑性。

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  循环经济价值：直接利用混合VFAs避免了昂贵分离流程，降低生物肥料生产成本（碳源占可变成本54%），契合农业可持续发展需求。

局限性包括温室试验中接种剂量不足、采样时间较早，以及缺乏功能基因（如nifH）与活性（如乙炔还原 assay）的直接验证。未来需结合宏基因组、宏转录组与培养组学，鉴定关键功能菌株并优化群落稳定性。

结论

微生物组工程结合废弃物衍生的VFAs，为设计高效、低成本的固氮生物肥料提供了新途径。所构建的自组装群落不仅固氮效能显著，还能促进作物生长、调节根际微生态，且效果与合成氮肥相当。该策略实现了废弃物资源化、农业绿色生产与循环经济的多目标协同，具有广泛的应用潜力。