维生素D诱导抗菌肽LL-37结合SARS-CoV-2刺突蛋白及辅助蛋白ORF7a与ORF8的机制与抗病毒作用研究

本研究发现维生素D诱导的抗菌肽LL-37通过结合SARS-CoV-2 Spike蛋白（S1、S2、RBD结构域）及辅助蛋白ORF7a和ORF8，有效抑制病毒与宿主受体hACE2的结合，并可能恢复自噬功能，为COVID-19的防治提供了新的分子机制与治疗策略。

　　

背景

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起，全球已导致超过700万人死亡。尽管当前奥密克戎变异株的致死率显著降低，但每日仍有患者因该病死亡。现有疫苗主要靶向病毒刺突糖蛋白（Spike）或其受体结合域（RBD），但不断出现的变异株（如Delta和Omicron）在Spike蛋白上的突变影响了疫苗的保护效果。SARS-CoV-2基因组约30 kb，除编码Spike蛋白外，还编码6种辅助蛋白，包括开放阅读框8（ORF8）和ORF7a。ORF8可形成二聚体，与病毒的高效传播相关，并通过下调主要组织相容性复合体I类（MHC I）分子帮助病毒逃逸细胞毒性T细胞识别。ORF7a则通过调控自噬过程增强病毒毒力：它启动自噬但抑制自噬体与溶酶体的融合，从而帮助病毒逃逸降解并促进复制。

维生素D在COVID-19感染率和疾病结局中的作用一直存在争议，但多项研究表明，维生素D治疗可改善预后并减少重症监护需求。维生素D的抗病毒活性已在体外和体内针对多种病毒得到证实。维生素D通过结合维生素D受体（VDR）并进一步与维生素D反应元件（VDRE）结合发挥作用。人cathelicidin基因启动子区存在VDRE共识序列，因此维生素D可强烈上调抗菌肽LL-37的前体——cathelicidin的表达。LL-37由37个氨基酸组成，整体带正电荷（+6），可通过静电作用与微生物膜上带负电荷的分子结合，直接清除微生物。此外，该肽还具有抗病毒活性，如抑制单纯疱疹病毒1型、痘病毒、逆转录病毒和某些腺病毒血清型的复制。LL-37可通过直接抑制病毒、促进中性粒细胞胞外诱捕网（NET）清除、增强内皮修复及调节炎症反应等多种机制预防重症COVID-19。LL-37与介导病毒进入的ACE2受体的相互作用也已得到证实。口服LL-37可缩短COVID-19患者的核酸清除时间，改善治疗效果。

材料与方法

为研究LL-37与SARS-CoV-2的相互作用，我们使用重组表达的Spike（带Strep或His标签）、扩展S1亚基（S1e）、受体结合域（RBD）、S2亚基、辅助蛋白ORF8和ORF7a，以及人血管紧张素转换酶2（hACE2）作为阳性对照。所有蛋白质通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色验证完整性和纯度。

通过表面等离子共振（SPR）分析LL-37与病毒蛋白的结合动力学和亲和力。将SARS-CoV-2蛋白偶联到CM5传感器芯片上，注入浓度0-1280 nM的LL-37，监测结合与解离过程，并计算平衡解离常数（K_D）。竞争实验通过先注入LL-37后立即注入hACE2（共注射模式），评估LL-37对Spike与hACE2结合的抑制能力，计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

负染电子显微镜（EM）用于可视化LL-37与Spike和ORF8的结合。样品吸附到碳覆网格上，用醋酸铀酰染色后，在透射电子显微镜下观察。使用金标记抗Strep抗体识别Strep标签蛋白，LL-37和控制肽直接与胶体金偶联以便观察。

结果

重组蛋白表达与验证

成功表达并纯化了Spike_Strep（139 kDa）、Spike_His（136 kDa）、S1e（83 kDa）、RBD（26 kDa）、S2（65 kDa）、ORF8（单体16 kDa）和ORF7a（32 kDa）。SDS-PAGE显示所有蛋白条带大小符合预期，纯度良好。

SPR相互作用分析

LL-37与Spike_His和Spike_Strep均结合，K_D值均为410 nM。阳性对照hACE2与Spike的结合K_D为370 nM。LL-37与RBD、S1e和S2的结合K_D分别为220 nM、200 nM和230 nM，表明LL-37与Spike的多个结构域相互作用。hACE2与RBD和S1e结合（K_D分别为940 nM和610 nM），但不与S2结合，证实了结合特异性。

LL-37与ORF7a的结合最强，K_D为138 nM；与ORF8的结合K_D为290 nM。所有传感器图显示，LL-37在约100秒后信号下降，可能由于其浓度依赖性寡聚化所致。LL-37可形成四聚体通道，其在溶液中的单体与寡聚体比例约为4:6，动态变化可能影响结合曲线。

竞争结合研究

LL-37能浓度依赖性地抑制hACE2与Spike_Strep、S1e和RBD的结合，IC₅₀值分别为670 nM、160 nM和120 nM。Spike的IC₅₀值高于RBD，因为LL-37不仅结合RBD，还结合Spike的其他结构域。根据K_D值比例，约6个LL-37分子与一个Spike结合。

负染电子显微镜观察

电镜显示，Spike呈棒棒糖状粒子，球形头部为S1亚基，尾部为S2亚基。金标记抗Strep抗体结合于S2尾部。金标记LL-37结合于Spike的头部和尾部，形成 halo 样结构，最多可见7个LL-37分子围绕一个Spike，与SPR推测的6:1结合比一致。

ORF8呈单体或二聚体 globular 结构。金标记LL-37与ORF8结合，每个单体结合一个LL-37分子。控制肽（29个氨基酸的α螺旋结构）无结合。

讨论

疫苗显著降低了重症COVID-19的发生率，但无法提供完全保护，且病毒变异导致疫苗效果减弱。ORF8在免疫逃逸中起关键作用，但因其低免疫原性，目前尚无针对它的治疗策略。

本研究证明LL-37以纳摩尔级亲和力结合Spike的多个结构域（RBD、S1e、S2），并通过形成 halo 样结构阻断Spike与hACE2的结合。这种广泛结合模式可能使LL-37对多种病毒变异株有效，因为其作用不依赖特定受体相互作用，而是通过静电、疏水作用或两亲性实现。LL-37还可直接结合ACE2，进一步增强其抗病毒潜力。

此外，LL-37与ORF7a的高亲和力结合（K_D=138 nM）可能恢复自噬功能：ORF7a通过降解SNAP29抑制自噬体与溶酶体融合，而LL-37被巨噬细胞内化后进入内体和溶酶体，可能逆转这一过程，促进病毒降解。

LL-37与ORF8的结合（K_D=290 nM）可能屏蔽其功能，如抑制MHC I下调、干扰素信号抑制和IL-17通路激活，从而减轻炎症反应和血栓形成风险。ORF8缺失变异株与较低炎症因子水平相关，提示靶向ORF8可能改善疾病结局。

LL-37还具有免疫调节功能，可降低GM-CSF、RANTES、IL-1β和IL-17等促炎因子水平，可能缓解COVID-19的超炎症综合征。然而，LL-37也促进NETosis，与组织损伤和免疫血栓形成相关，且可增强凝血因子活性，需谨慎评估其治疗风险。

综上，LL-37通过多重机制对抗SARS-CoV-2：抑制病毒进入、恢复自噬、阻断辅助蛋白功能及调节免疫反应。维生素D诱导内源性LL-37上调或直接给药（如吸入）可能成为COVID-19的防治策略。抗菌肽的临床应用已进入试验阶段，加速了LL-37治疗COVID-19的转化潜力。