野生与实验室大鼠（Rattus norvegicus）警觉性与应激适应系统的比较神经生物学研究：揭示自然选择下的神经内分泌与微血管适应性机制

本研究通过比较野生与实验室大鼠的神经生物学差异，揭示了野生大鼠在持续环境压力下表现出的高度HPA轴活性（肾上腺增大、糖皮质激素代谢物升高）、关键脑区（如海马、听觉皮层、缰核）的神经元与胶质细胞重塑以及微血管密度增强等适应性特征，为理解应激相关疾病（如抑郁、焦虑）的神经机制提供了重要的转化视角。

　　

1 Introduction

实验室饲养的大鼠生活在高度控制的环境中，行为可预测且缺乏复杂刺激，而野生大鼠则长期面临捕食者、毒素等持续威胁，需要保持高度的警觉性。上世纪中叶，Curt Richter就发现野生大鼠的肾上腺比实验室大鼠大300%，近期研究进一步证实野生大鼠的肾上腺重量增加了320%，粪便糖皮质激素代谢物（FCMs）升高600%，表明其下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）活性显著增强。这种高HPA活性与警觉性（定义为持续的注意和紧张性警觉状态）密切相关，是野生环境生存所必需的神经生物学基础。

除了肾上腺差异，野生和实验室大鼠在生存相关脑结构上也存在显著区别。例如，野生大鼠和野兔的杏仁核体积更大，而长期应激通常会导致海马等脑区的神经萎缩。然而，先前研究发现野生大鼠的小脑神经元密度反而更高，脑体积更大，提示其可能存在独特的神经适应性。值得注意的是，最近一项使用F3代野生大鼠的研究发现其小脑体积较小，Purkinje神经元数量与实验室品系相当，表明发育过程中的野生环境暴露是影响脑结构的关键因素。

慢性应激环境的神经内分泌适应可能由盐皮质激素受体（MR）等分子机制驱动。MR主要分布在海马和杏仁核等边缘系统，尤其在CA2区浓度最高，该区域与可塑性功能、社会识别和应对评估相关。MR与糖皮质激素受体（GR）在海马共定位，但对糖皮质激素的亲和力比GR高10倍。高糖皮质激素水平与行为和神经警觉性增强有关。MR表达影响神经可塑性相关基因的转录，包括生长因子和细胞粘附分子，因此参与应激刺激的初始评估和后续记忆形成，可能影响未来对类似应激环境的反应。临床研究中，MR激活不足与抑郁、焦虑和精神分裂症等精神疾病相关，而抗抑郁药如丙米嗪可增加海马MR mRNA表达。

另一个与应激适应相关的分子是脱氢表雄酮（DHEA）。DHEA及其硫酸盐（DHEA-S）在人类由肾上腺产生，在大鼠和小鼠则由性腺产生。DHEA也在大脑中合成，可调节谷氨酸（如NMDA）和GABA神经化学系统。DHEA是急性应激的标志物，具有抗糖皮质激素特性，其水平与抑郁发作强度呈负相关，可能对焦虑障碍、痴呆等有临床意义，并在脑损伤后提供神经再生作用。因此，MR和DHEA功能都与长期应激暴露下的情绪韧性相关。

实验室中的丰富环境（如更大空间、社会饲养和新奇刺激）可诱导与自然栖息地一致的神经和行为适应，例如皮层增厚、海马可塑性标志物增加和更复杂的神经元结构。在脑卒中模型中，丰富环境饲养的动物表现出血管生成增加和更快恢复速率，表明经验或环境相关的微血管变化可改变脑血管结构和血管修剪。然而，尽管丰富环境模拟了自然栖息地的某些方面，它们缺乏野生大鼠面临的持续不可预测应激源，可能无法驱动同样强健的神经生物适应。即使包含物种相关刺激的自然丰富实验室环境，也无法复制真实自然栖息地的持续威胁存在。此外，实验室中食物、水、庇护所和温度调节恒定，而野生大鼠这些资源稀缺且不可预测。为生存，野生大鼠必须准确评估风险并采取适当的应对和决策策略。因此，感觉和运动皮层的高度敏感性可能促进对实时威胁的反应，增强生存概率。先前研究还表明，外侧缰核（LHb）作为内部情绪过程与外部环境的接口，参与应对评估，促进威胁情境中的冻结反应，实现快速高效响应。除边缘结构如海马和杏仁核外，多个脑区参与决策和应激反应，这些反应塑造警觉系统并最终影响野生动物的生存。

由于其明显的高皮质酮耐受性，野生大鼠为研究长期警觉状态下的应激适应机制提供了宝贵模型。尽管高HPA活性通常与负面脑和健康结果相关，但先前研究表明野生大鼠脑重健康，小脑神经元密度高，无组织受损证据。基于这些发现，本研究进一步探讨野生大鼠警觉性和韧性的神经基质，特别评估雄性和雌性野生及实验室匹配大鼠的以下目标机制：海马MR和GR免疫反应性、边缘和皮层微血管密度（MVC）、以及对应激刺激重要的皮层区域神经元/胶质细胞比率。同时评估HPA活性标志物，包括CORT和DHEA粪便代谢物、相对肾上腺重量。由于脾脏在应激和免疫功能中的作用，也收集了脾脏重量。假设野生大鼠MR免疫反应（MR-ir）水平更高、GR免疫反应（GR-ir）有区域特异性修饰、微血管覆盖（MVC）增加、目标皮层区域（如运动、体感、梨状、前扣带和听觉皮层）以及BNST、LHb和基底外侧杏仁核（BLA）的神经元和胶质细胞密度改变。预计野生大鼠脾脏和肾上腺更大。对这些机制的深入理解可提供实验室模型无法单独提供的应激适应关键见解。

2 Method

2.1 Animals

在2021年夏季的三个月中，于美国弗吉尼亚州里士满市活捉雄性（n=4）和雌性（n=7）野生大鼠（R. norvegicus）。麻醉后通过体重和生殖器官发育阶段估计年龄。雌性内脏进一步解剖确认无怀孕、分娩或哺乳迹象。一雌三雄估计为未成年或预成年。实验室对照Long Evans大鼠（雄4，雌7）与野生大鼠体重和性别匹配。在组织收集前至少适应标准实验室饲养条件5天。雄鼠配对饲养，四雌配对，三雌群养。兽舍维持12小时光周期（7:00 AM至7:00 PM），温度22°C ± 1°C，湿度45%-55%。研究经里士满大学动物护理和使用委员会批准。

激素和大体解剖评估包括两性，神经/细胞定量（包括免疫组化实验）仅含雌性，因雄性组织处理错误。

2.2 Trapping and tissue collection

陷阱预诱48小时后设置，次日晨回收。捕获后运至户外现场实验室，先用异氟烷镇静，再腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（400 mg/kg）。无反应后快速断头处死。

脑立即提取并沿脑裂半切。右半球干冰速冻用于另一转座子元件（TE）评估研究。左半球4%多聚甲醛后固定24小时，再转入10%、20%和30%蔗糖溶液冷冻保护。

脾脏和肾上腺切除后放入预称重标记管，湿冰保存。新鲜组织称重，小瓶总重减瓶重得器官重。此解剖和称重程序最小化野生大鼠器官病原体暴露。

2.3 Hormone assessments

从粪便球中提取糖皮质激素（主要为CORT，通过FCMs测量）和粪便DHEA代谢物（FDMs），使用ELISA试剂盒评估。野生大鼠粪便在组织收集时从直肠或远端结肠采集，立即-80°C保存。实验室动物在放入新家笼前收集新鲜粪便，时间约10:00 AM以最小化昼夜效应。实验室大鼠粪便在运输后立即收集以模拟野生大鼠陷阱和迁移应激。先前工作表明CORT和DHEA水平滞后血液浓度约12小时。

样本室温解冻后，65°C ± 5°C孵育过夜干燥。干燥粪便再次称重，要求重量减少约50%且干燥坚硬。按0.09 g粪便材料:1.0 mL甲醇比例制浆，调整至各样本最终干重。金属探针破碎粪便，甲醇均质。探针样本间用新鲜甲醇或100%乙醇消毒擦干。均质后室温静置30分钟使固体沉淀。

取20 μl上清液，按1:20加 assay buffer稀释，混匀后重复孔加样。最终稀释度1:40。浓度对标准曲线测量。BioTek ELx800酶标仪405 nM读板。净OD值（样本OD - 空白OD）外推标准曲线计算最终浓度（pg/mL）。重复孔OD值设变异系数（CV）限±10%。超出标准曲线样本稀释重测。据制造商，CORT和DHEA试剂盒对目标激素特异性高，结构相关类固醇交叉反应性<1%。

2.4 Immunohistochemistry and cytoarchitectural analyses

因灌注过程组织完整性挑战，组织学实验仅对雌性野生和实验室大鼠进行。左半球后部浸OCT化合物后-25°C冷冻切片机定位。取40 μm厚游离切片，选自海马前部、BLA、LHb、听觉皮层、扣带皮层、运动皮层、梨状皮层和体感皮层，置PBS + 0.1%叠氮化钠中。每个感兴趣区域和组织学程序，重复切片每隔6^th连续切片，最小距离200μm确保每个细胞只计数一次。所有目标区域通过硫堇染色评估神经元和胶质细胞密度。

硫堇染色组织（显示细胞体） mounted 到明胶包被玻片，室温干燥过夜后暴露于硫堇组化协议（0.1%稀释），Permount封片。细胞计数从目标区域（背海马、运动皮层、LHb、梨状皮层、听觉皮层、前扣带皮层和BLA）收集。Zeiss Axioscope M.2光镜与Neurolucida 360软件分析。神经元和胶质细胞（广义）在40x放大下200x300 μm视野内用独特数字标记计数。每个区域每个动物至少两个组织切片（平均四个切片）计数，平均得最终代表估计。

免疫组化处理，所有游离切片PBS洗10分钟去除残留多聚甲醛和叠氮化钠。GR、MR和CD-31（微血管标志物，与微血管-MR染色共用）组织暴露于抗原修复步骤：切片置含10mM柠檬酸钠PBS中，75°C水浴30分钟。冷却至室温后继续染色协议。免疫反应性用以下一抗和浓度评估：抗盐皮质激素受体[rMR1-18 9C2 IgG1; 1:400稀释，Gomez-Sanchez实验室馈赠]，抗糖皮质激素受体（GR Ab-226; 1:750稀释），抗-CD-31（Abcam TLD-3A12, 1:100稀释）。为可视化免疫反应性，切片暴露于DAB底物约10分钟。染色切片 mounted 到明胶包被玻片，Permount封片。GR-ir和MR-ir细胞在40x放大下用Neurolucida 360软件在海马CA1、CA2、CA3、听觉皮层、BLA和前扣带皮层量化。每个区域至少两个组织切片（平均四个切片每半球）评估，细胞计数平均得最终代表估计。所有量化用标准大小视野（200x300 μm）。所有目标蛋白，阴性对照（染色过程省略一抗） included 验证观察免疫反应性特异性。

MVC分析，前扣带皮层和齿状回MR-ir或CD-31免疫反应（CD-31-ir）组织染色微血管面积百分比，用图像阈值工具突出目标免疫反应组织，40x放大。MVC分析因变量为视野（200x300 μm）含MR-ir或CD-31-ir组织百分比，由Ilastik交互机器学习图像分类系统确定。

2.5 Statistical analyses

使用SPSS Statistics version 29分析。内分泌数据通过双因素ANCOVA（2 × 2; 性别 × 环境）分析，体重为协变量。适当处Tukey事后检验 pairwise 比较。脾脏和肾上腺数据，表示为腺体-体重比以 account 体重差异，用双因素ANOVA分析。免疫组化结果用双尾独立样本t检验比较野生和实验室雌鼠。数据满足正态性假设除非另述。统计显著性设α = 0.05。因雌性神经评估多重比较，Bonferroni校正控制家族wise错误率，每个脑区（如LHb）视为独立家族。调整alpha水平计算为α_adjusted = α/m，个体p值对这些阈值评估。所有图用GraphPad Prism version 9.0生成。图显示均值 ± 标准误（SEM），适当处显示个体数据点。为减少冗余，图中数据均值文中不重复。但，未图示无显著性趋势，组均值包含在叙述中便于解释。类似图，所有报告均值表示为均值 ± SEM。

3 Results

3.1 Anatomical measurements

双因素ANOVA显示性别和栖息地对脾脏-体重比有显著交互作用（F_1,18=6.053, p = 0.024, ηp2 = 0.252）。事后比较表明雄性组间无显著差异；但野生雌鼠脾脏相对体重显著重于实验室雌鼠。此外，双因素ANOVA显示栖息地对肾上腺-体重比有主效应（F_1,18=55.103, p < 0.001, ηp2 = 0.754），野生大鼠相对肾上腺重量显著大于实验室大鼠。

3.2 Endocrine assays

双因素ANCOVA显示栖息地对粪便CORT代谢物（FCMs）有显著主效应，野生大鼠FCM水平显著高于实验室大鼠（F_1,17=34.09, p < 0.001, ηp2 = 0.670）。FCM无性别显著差异。另一双因素ANCOVA表明性别对粪便DHEA代谢物（FDM）水平有显著主效应，雌性水平显著高于雄性（F_1,17=11.14, p = 0.004, ηp2 = 0.396）。虽不显著，野生大鼠FDM水平高于实验室大鼠趋势（F_1,17=3.54, p = 0.077, ηp2 = 0.172）。第三双因素ANCOVA显示栖息地和性别对DHEA: CORT代谢物比有显著主效应。实验室大鼠DHEA: CORT比显著高于野生大鼠（F_1,17=8.023, p = 0.011, ηp2 = 0.321），雌性比高于雄性（F_1,17=4.788, p = 0.043, ηp2 = 0.220）。

为确认运输对实验室大鼠是应激源（由升高FCM水平指示），进行重复测量分析。运输后立即FCM水平显著高于适应5天后（F_1,9=17.27, p = 0.002, ηp2 = 0.657）。实验室大鼠运输后立即样本（为控制与野生大鼠比较的迁移因素）FCM水平显著高于适应5天后（到达 = 2278.08±360.46; 适应 = 694.16±107.075）。

3.3.1 Thionine detection of neuronal and glial cells

硫堇染色组织检查野生和实验室雌鼠（n = 7每组）。对于外侧缰核，Bonferroni校正后（α = 0.0167，此脑区家族内三比较），独立样本t检验显示栖息地对评估LHb视野神经元数有显著效应（t₇ = 3.352, p = 0.012, d = 2.248），野生雌鼠神经元显著多于实验室雌鼠。LHb神经元与胶质细胞比也显著组间不同（t₇ = 3.409, p = 0.011, d = 2.287），野生雌鼠比更高。LHb胶质细胞数无显著差异。

皮层区域，t检验表明听觉皮层神经元数显著差异（t₉ = 4.602, p = 0.001, d = 2.885），Bonferroni校正后（0.05/4，调整α = 0.0125）此脑区四比较。野生雌鼠此区域神经元显著多于实验室雌鼠。虽野生雌鼠听觉皮层胶质细胞比实验室雌鼠增加16%（野生: M=154.15 ± 7.29; 实验室: M=131.97 ± 1.67），此差异不显著。听觉皮层神经元-胶质比无显著差异。梨状皮层，Bonferroni校正t检验（0.05/3，调整α = 0.0167）显示栖息地对胶质细胞计数有显著效应（t₈ = 3.965, p = 0.004, d = 2.559），野生大鼠胶质细胞多于实验室大鼠。梨状皮层神经元数或神经元-胶质比无显著差异。体感皮层，胶质细胞数无显著差异（Bonferroni校正: 0.05/3, α = 0.0167），但野生雌鼠比实验室雌鼠增加16.2%（野生: M=78.68 ± 4.85; 实验室: M= 67.71 ± 1.76）。此区域神经元计数或神经元-胶质细胞比也无显著差异。运动皮层，栖息地对神经元数、胶质细胞数或神经元-胶质细胞比无显著效应。

齿状回，组间神经元计数、胶质细胞计数或神经元-胶质比无显著差异。但野生雌鼠胶质细胞计数比实验室雌鼠高26.4%（野生: M=82.16 ± 6.99; 实验室: M=64.99 ± 4.29）。类似，终纹床核（BNST）任何评估指标无显著组差异。

3.3.2 Corticosteroid and mineralocorticoid receptor immunoreactive cells

GR-ir和MR-ir细胞在雌鼠多个脑区评估，包括海马CA1、CA2、CA3区；运动、听觉和前扣带皮层；和基底外侧杏仁核（BLA）。

Bonferroni校正后（0.05/3，调整α = 0.0167），t检验显示栖息地对CA2 GR-ir细胞数无统计显著效应。但野生大鼠GR-ir细胞比实验室大鼠增加36%（野生: M=57.8 ± 4.97; 实验室: M=42.5 ± 1.94）。CA3，Bonferroni校正后（0.05/3，调整α = 0.0167）无显著差异（野生: M=49.64 ± 4.04; 实验室: M=40.0 ± 1.74）。类似，CA1无统计显著差异（野生: M=58.67 ± 6.47; 实验室: M=44.73 ± 2.90）。其余目标区域（运动皮层、听觉皮层、BLA和前扣带皮层）GR-ir细胞无显著差异。

聚焦MR-ir细胞，t检验显示CA2 Bonferroni校正后（0.05/3，调整α = 0.0167）无显著差异。但野生大鼠MR-ir细胞计数比实验室大鼠增加26%（野生: M=58.59 ± 3.36; 实验室: M=46.29 ± 6.48）。CA1或CA3 MR-ir细胞无显著差异。此外，海马CA1、CA2或CA3区MR-ir:GR-ir细胞比组间无显著差异。

3.3.3 Microvasculature immunoreactivity

MR和CD-31免疫反应性用于评估前扣带皮层和齿状回微血管覆盖（MVC）。Bonferroni校正后（0.05/6，调整α = 0.00833），栖息地对齿状回MR-ir细胞有显著效应，野生雌鼠MR-ir细胞计数显著高于实验室雌鼠（t₉ = 3.403, p = 0.008, d = 2.06）。相反，前扣带皮层MR-ir细胞组间无显著差异。此外，齿状回CD-31免疫反应性野生和实验室雌鼠无显著差异。

4 Discussion

本研究旨在探索野生R. norvegicus警觉性和情绪韧性的神经生物学变量，提供实验室模型无法完全捕捉的生存相关反应见解。为区分这两个概念，视警觉性为感觉、皮层和缰核神经适应指标，而韧性通过应激激素谱和受体分布评估。结果复制并扩展了实验室先前报告，表明野生大鼠比实验室繁殖啮齿类应激反应性增强。具体，先前发现野生大鼠粪便CORT和DHEA代谢物显著增加，肾上腺和脾脏更重。本研究中野生大鼠同样FCMs显著更高，肾上腺和脾脏更重。由于样本量小（野外研究用陷阱动物常见挑战），未达调整显著性阈值发现应谨慎解释，因意图最小化I型和II型错误。因此，效应大小估计和多个变量一致模式指向潜在生物相关趋势值得进一步调查（如下所述）。这些当前发现结合先前研究结果，表明野生大鼠表现适应性应激反应支持持续警觉性，可能贡献其高风险环境生存。

本研究中，齿状回胶质细胞密度和微血管化（MVC）增加，前扣带皮层无效应（重要指出MVC效应未在CD-31数据中观察到，可能因未灌注但后固定组织）。虽不统计显著，CA2 GR-ir细胞增加表明这些受体分布和反应性值得进一步调查。海马这些观察指向威胁、韧性和记忆处理潜在神经生物适应——野生栖息地生存关键反应。此外，野生大鼠LHb神经元-胶质细胞比和神经元密度更高，听觉皮层神经元密度增加，梨状皮层胶质增加。总之，这些结果指向野生大鼠感觉处理和应激适应改变；但，考虑脑数据收集自雌鼠，推广到雄鼠应谨慎。

本研究神经生物学发现反映警觉性和威胁反应性潜在机制，自然环境中生存关键特质。例如，当前数据集中，升高糖皮质激素水平可能导致唤醒和环境威胁敏感性增加。野生大鼠应激激素反应变异性也可能反映特定环境挑战中应激激素更精细调节。但，本研究限制缺乏纵向激素测量，不清楚应激标志物在非威胁情境（如相对安全巢区）是否降低。有趣的是，先前研究野生林鼠捕获迁移实验室栖息地后，CORT水平四周内急剧下降，表明野生小鼠HPA轴反应性相当灵活性。

与假设相反，观察到野生大鼠更低DHEA/CORT比——通常见于韧性较低实验室啮齿类和人类。虽野生大鼠更低DHEA: CORT比最初似乎与实验室啮齿类衍生韧性模型不一致， several 生物因素可能贡献此差异。第一，野生雌性繁殖状态差异——尽管无明显怀孕迹象——可能影响DHEA生产， given 性腺影响此激素。此外，粪便激素采样反映整合激素活性 over time，可能未捕获瞬时DHEA峰值或调节反馈循环。也可能野生大鼠通过进化适应，发展改变受体敏感性、增强局部合成或替代应对机制——需要进一步探索变量。这些发现强调解释韧性激素指标时考虑生态和生理背景重要性。

延伸自HPA系统神经生物学元素，LHb——处理厌恶和奖励刺激关键区域——野生大鼠表现增加胶质免疫反应性。此区域整合多模态感觉输入，贡献决策过程关键响应环境威胁。虽不显著，海马CA2区GR-和MR-ir修饰也可能影响空间记忆和导航，野生中识别和避免潜在威胁关键功能。此区域需要进一步调查，但改变CA2活性可能帮助解释野生大鼠 well-documented 诱饵回避现象。最后，多个皮层区域神经元和胶质修饰 observed，与野生栖息地实时威胁响应相关。具体，梨状和听觉皮层区域改变细胞分布值得注意 given 它们嗅觉和听觉检测威胁刺激贡献。一起，这些感觉系统提供有价值信息关于捕食者或其他威胁动物环境中存在。

野生大鼠增加脑MVC证据，尤其齿状回，本研究中 observed。增加MVC可能增强营养运输和血流 essential 环境挑战实时响应。此外，交感诱导外周血管收缩和增加血流促进成功逃脱捕食者，响应 influenced by MR介导血压改变和血管重塑。虽野生大鼠前扣带皮层微血管与实验室对应统计不显著差异，野生大鼠值也更高。提供MVC分布警觉响应作用支持，修改脑血流与实验室大鼠自然捕食者刺激韧性响应相关。因此，未来研究应探索微血管促进快速逃脱行为和威胁响应作用。此外，虽本研究因现场限制无法灌注动物，使用灌注野生陷阱脑组织对未来调查有信息。

未来探索另一感兴趣区域是转座子元件（TEs）潜在作用，如长散在核元件（LINE1），在野生大鼠适应动态环境中基因组可塑性和免疫功能。实验室初步数据，从独立队列获得，表明野生和实验室大鼠LINE1表达可能差异，值得进一步目标调查。

如前所述，野生动物面临持续应激源如捕食、季节变化和人为栖息地破坏，使野生大鼠成为调查不可预测环境生存必需适应性响应宝贵模型。野生和实验室动物 distinct 应激反应强调调查野生模型重要性 addition 传统实验室模型以捕捉慢性应激神经生物适应全谱。而实验室动物暴露慢性应激常表现改变神经结构（如海马萎缩）和抑制免疫功能，野生动物似乎进化独特应对机制减轻高皮质酮水平相关 adverse 健康效应。

虽当前发现特定城市野生R norvegicus种群，它们提供有价值见解自然生态条件塑造应对机制。跨多样物种和栖息地额外调查需要确定这些神经生物适应普遍性。虽野生栖息地与标准实验室设置显著不同——动物经历有限感觉输入和最小认知需求——可能时整合物种相关和生态有意义特征到实验室环境重要。最终，验证实验室为基础发现与跨多样自然情境野生种群数据对确保临床前模型转化相关性 essential。

本研究发现强调神经行为学方法重要性——检查自然栖息地野生动物——作为 uncover 适应性应激反应手段具人类健康潜在相关性。虽潜在机制待确定，如此韧性可能指向生物过程，如果更好理解，最终可能 inform 管理人类慢性应激新策略。神经内分泌和血管适应，特别，代表未来调查有希望途径，包括调节糖皮质激素受体（GR）活性或增强MVC支持应激敏感脑区。此外，关于皮质酮结合球蛋白（CBG；也称为transcortin）信息将提供进一步澄清野生大鼠管理升高外周CORT水平。因此，虽转化应用此阶段推测，野生大鼠模型强调调查自然情境动物重要性以揭示实验室设置不可检测韧性和警觉通路。