克罗恩病活动期患者外周血单核细胞对GM-CSF的功能响应性研究及其细胞治疗潜力

本研究揭示了活动期克罗恩病（aCD）患者的外周血单核细胞在体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）激活后，仍能保持与健康供体（HD）相当的迁移、黏附、代谢及细胞因子分泌功能。GMaMs（GM-CSF激活的单核细胞）表现出增强的炎症因子（如IL-8、MCP-1）释放能力和表面标志物（CD54、HLA-DR）重塑，且对LPS刺激产生强效反应，支持其作为细胞疗法用于纠正aCD先天性免疫缺陷的潜力。

　　

引言：

克罗恩病（Crohn’s disease, CD）是一种慢性复发性炎症性肠病（IBD），目前无法根治。尽管现有抗炎治疗方案多样，但30–60%的患者会产生耐药性，亟需新的治疗策略。小鼠结肠炎模型数据显示，经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）激活的单核细胞（GMaMs）可能成为一种有前景的细胞疗法。然而，在活动期CD（aCD）中，炎症介质、药物或单核细胞自身是否存在功能缺陷，从而影响其治疗效果，尚不明确。

材料与方法：

研究纳入8例aCD患者和健康供体（healthy donors, HDs），通过负选法分离经典单核细胞（CD14⁺/CD16^-），体外以GM-CSF（10 ng/mL）激活，评估其迁移能力、黏附性、代谢活性、表面标志物表达及细胞因子释放。同时采用脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）刺激模拟细菌感染环境，并利用流式细胞术、ELISA、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等技术分析细胞反应与代谢物变化。

结果：

3.1 GM-CSF激活后aCD与HD单核细胞体积增大、细胞因子分泌增强

分离后aCD患者单核细胞产量与体积均显著高于HD，但存活率无差异。GM-CSF激活24小时后，两组细胞均出现体积增大，并显著提升多种炎症因子分泌，包括IL-1β、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α和IL-10。值得注意的是，aCD来源单核细胞在GM-CSF刺激下IL-10分泌显著高于HD，且IFN-γ与IL-33分泌仅在该组显著上升。

3.2 aCD与HD来源GMaMs功能相似

GM-CSF激活后，aCD与HD单核细胞黏附能力、代谢活性（WST-1法检测）均显著增强。迁移实验显示，总迁移能力无组间差异，但GMaMs迁移后更易黏附于transwell小室底部，非黏附细胞数量减少。

3.3 GM-CSF激活后表面标志物表达变化一致

GM-CSF激活诱导CD54（ICAM-1）表达升高、CCR2（CD192）与CX3CR1表达下降，且在aCD与HD中趋势一致。aCD单核细胞基线CD64表达较高，培养后下降；HLA-DR在aCD组基础表达即较高，GM-CSF激活后进一步上调。

3.4 LPS刺激下细胞因子反应高度一致，除IFN-γ与IFN-α2

LPS刺激后，GMaMs与未激活单核细胞均大量分泌MCP-1、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β等促炎因子，且两组间无显著差异。但aCD来源GMaMs在LPS刺激下IFN-γ分泌缺失，而IFN-α2反应在HD中更强。

3.5 GM-CSF诱导表型稳定持续

无需LPS再刺激，GMaMs在24小时内维持高分泌MCP-1、IL-8、IL-18、TNF-α、IL-1β、IFN-α2、IL-33和IL-12p70的能力，且TNF-α/IL-10比率显著升高，显示其活化状态的稳定性。

3.6 LPS激活后KYN通路代谢变化与能量代谢增强

LPS刺激后，所有单核细胞色氨酸（tryptophan, TRP）水平下降、犬尿氨酸（kynurenine, KYN）上升，KYN/TRP比率升高，但GMaMs中这一变化较未激活细胞更弱。同时，喹啉酸（quinolinic acid, QUIN）——NAD⁺合成前体——显著上升，aCD来源GMaMs代谢活性进一步增强，提示活化细胞能量需求上升。

讨论：

本研究证实，aCD患者外周血单核细胞在GM-CSF激活下仍保持强大的功能响应能力，其GMaMs表型兼具促炎（如高分泌IL-8、MCP-1以招募中性粒细胞与单核细胞）和免疫调节（如升高IL-10、降低TNF-α/IL-10比率）特性。尽管aCD单核细胞基线状态显示一定活化（如CD64高表达），且对LPS的IFN-γ反应缺失，可能反映其内在免疫调节异常，但并未影响GMaMs整体功能表现。其表面标志物重塑（如CD54、HLA-DR、CD86上调）也支持其增强的抗原呈递与T细胞活化能力。IDO-KYN通路的激活及QUIN积累进一步提示GMaMs在炎症环境下具有代谢重编程潜力。综上所述，GMaMs作为一种细胞疗法，有望通过局部递送免疫调节信号与强化细菌清除，弥补aCD患者先天性免疫缺陷，具有显著的转化前景。