乳酸链球菌素、尿石素B与长春新碱三联疗法通过多靶点协同作用抑制淋巴瘤细胞增殖并诱导凋亡：蛋白质组学证据

本综述系统探讨了乳酸链球菌素（Nisin, N）、尿石素B（Urolithin B, UB）与长春新碱（Vincristine, Vinc）三联疗法对人类淋巴瘤细胞的协同抗增殖及促凋亡效应。研究通过细胞活力测定（Alamar Blue）、联合指数（CI）模型、活性氧（ROS）检测、流式细胞术（Annexin V/7-AAD）及无标记定量蛋白质组学（LC-MS/MS）等多维度分析，揭示该组合通过上调MAP1LC3B2、GMNN等促凋亡蛋白，下调NNMT、PLTP等致癌代谢蛋白，协同抑制MAPK-Akt信号通路、激活铁死亡并破坏脂质代谢，为淋巴瘤的靶向治疗提供新策略。

　　

1 引言

淋巴瘤作为一组高度异质性的血液系统恶性肿瘤，其治疗仍面临巨大挑战。长春新碱（Vincristine, Vinc）作为CHOP方案的核心组分，虽具显著疗效，但其剂量依赖性神经毒性等副作用严重限制临床应用。近年来，天然生物活性物质与肠道微生物代谢产物（后生元）与化疗药物的联合应用成为肿瘤治疗的新策略。乳酸链球菌素（Nisin, N）是一种由乳酸乳球菌产生的抗菌肽，通过膜穿孔诱导凋亡和氧化应激发挥抗癌作用；尿石素B（Urolithin B, UB）则是肠道菌群代谢鞣花单宁的产物，具有抗炎、抗增殖及线粒体调控功能。本研究旨在探索N、UB与Vinc三联疗法对人类淋巴瘤细胞系（HKB-11和Hs 313.T）的抗增殖与促凋亡效应，并借助蛋白质组学技术深入解析其分子机制。

2 材料与方法

2.1 化学品与药物制备

N、UB和Vinc购自Sapphire Bioscience，多柔比星（Doxorubicin, Dox）购自Sigma Aldrich。所有试剂均按标准方法配制。

2.2 细胞培养

人淋巴瘤细胞系HKB-11（ATCC CRL-12568）和Hs 313.T（ATCC CRL-7235）及正常基质细胞HS-5（ATCC CRL-3611）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。细胞在含10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素-链霉素的DMEM或DMEM/F12培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。

2.3 细胞活力测定

采用Alamar Blue法检测细胞活力。细胞以3×10⁵ cells/mL密度接种于96孔板，经24小时培养后，分别给予N:UB（3200:300 μM）、Vinc（0.94、0.63、0.31 μM）及三联组合（N:UB:Vinc为2240:210:0.94 μM、2560:240:0.63 μM、2880:270:0.31 μM）处理，72小时后测定荧光强度（Ex/Em=555/595 nm）。

2.4 协同效应分析

采用CompuSyn软件（v2.0）计算联合指数（Combination Index, CI）。CI<1表示协同效应，CI=1为相加效应，CI>1为拮抗效应。

2.5 ROS检测

使用H2DCFDA细胞ROS检测试剂盒（Abcam #ab113851）测定细胞内ROS水平。细胞经药物处理4小时后，测定荧光强度（Ex/Em=485/535 nm）。

2.6 流式细胞术分析凋亡

采用Annexin V-CF Blue/7-AAD凋亡检测试剂盒（Abcam #ab214663）处理细胞24小时，通过流式细胞仪（Novocyte 3,000）检测凋亡率，数据经NovoExpress软件分析。

2.7 蛋白质组学分析

2.7.1 细胞处理与蛋白提取

细胞经药物处理24小时后，裂解提取总蛋白。

2.7.2 蛋白定量与肽段制备

使用Pierce? BCA蛋白检测试剂盒定量，经胰蛋白酶/Lys-C酶解后，通过EasyPep? Mini MS样品制备试剂盒纯化肽段。

2.7.3 液相色谱-质谱分析

采用Waters M-Class微流高效液相系统联用SCIEX TripleTOF^? 6600质谱仪，以数据非依赖采集（DIA）模式进行质谱数据采集。

2.7.4 数据处理与通路分析

使用Spectronaut v19.5软件进行蛋白质鉴定与定量，以|Log₂FC|≥0.58且Q≤0.05为差异表达蛋白（DEPs）标准。通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集分析。

2.8 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用GraphPad Prism软件进行双因素ANOVA分析，p<0.05视为显著。

3 结果与讨论

3.1 三联疗法对淋巴瘤细胞的抗增殖活性与协同效应

三联组合在HKB-11细胞中表现出强协同效应（CI值0.31–0.50），在IC₉₀-IC₉₅水平实现近完全生长抑制（>99%），且对正常HS-5细胞毒性较低（ viability=42.09±1.21%）。中浓度组合（560:52.5:0.23 μM）在高效抑制淋巴瘤细胞（HKB-11抑制率98.55%，Hs 313.T抑制率93.88%）的同时，对HS-5细胞保持相对安全（viability=19.89%），展现出良好治疗窗口。

3.2 ROS生成水平分析

三联组合显著诱导HKB-11细胞内ROS升高，且呈剂量依赖性。最高浓度组合（2880:270:0.31 μM）ROS生成最为显著，表明氧化应激参与其细胞毒机制。阳性对照TBHP（150 μM）和Dox（4 μM）亦引起显著ROS升高。

3.3 流式细胞术分析凋亡特征

三联组合显著增加HKB-11细胞早期与晚期凋亡比例（p<0.0001），其中Vinc单药（0.63 μM）凋亡诱导最强，但伴随较高基质毒性。组合治疗则通过多途径（膜破坏、线粒体应激、微管扰动）协同诱导凋亡，且坏死比例低于Dox对照组，提示其更具选择性。

3.4 蛋白质组学表征

3.4.1 N:UB双药治疗诱导结构强化与免疫重编程

N:UB处理显著下调细胞周期调控蛋白CDK4（Log₂FC=-0.698）、CDK6（-1.07）和CDK1（-1.06），诱导G1期阻滞；同时上调细胞外基质稳定蛋白ITIH2（Log₂FC=6.5）、ITIH3（5.2）和免疫调节蛋白A2M（4.6）、C4BPA（4.9），抑制肿瘤侵袭与免疫逃逸。

3.4.2 Vinc单药治疗抑制转录与线粒体功能

Vinc下调RNA聚合酶II核心亚基POLR2A（Log₂FC=-1.7）及细胞周期调控因子NUCKS1（-1.3），诱导G1期阻滞；同时上调线粒体复合物I组分NDUFB8（Log₂FC=1.7），反映氧化磷酸化代偿性增强。

3.4.3 三联疗法协同破坏代谢、表观遗传与细胞周期调控

三联组合上调自噬相关蛋白MAP1LC3B2（Log₂FC=1.4）、复制抑制蛋白GMNN（1.3）及谷氨酰胺转运蛋白SLC38A2（1.5）；下调烟酰胺N-甲基转移酶NNMT（Log₂FC=-2.9）、磷脂转移蛋白PLTP（-2.5）及细胞色素P450酶CYP4X1（-2.0），抑制MAPK-Akt信号、激活铁死亡并破坏脂质代谢。IPA分析显示，组合治疗显著抑制细胞周期检查点、整合素信号、LXR/RXR脂代谢通路及IGF生长因子信号，同时激活HGF/VEGF应激补偿通路。

4 结论、局限与未来方向

本研究证实Nisin、尿石素B与长春新碱三联疗法通过多靶点协同作用——包括诱导ROS生成、激活凋亡与自噬、抑制致癌代谢及免疫调节——显著抑制淋巴瘤细胞增殖并增强化疗敏感性。蛋白质组学分析揭示了MAP1LC3B2、GMNN、NNMT等关键分子靶点及MAPK-Akt、铁死亡等信号通路参与机制。然而，研究仍存在局限：均为体外实验结果，N与UB的药代动力学参数未知，高浓度组合的生理相关性需进一步验证。未来研究需开展体内实验、优化给药策略（如纳米递送系统）、深化机制探索（如铁死亡作用）并筛选预测性生物标志物，以推动该联合策略的临床转化。