TGFβ1通过Smad3/Stat5/FoxP1信号轴调控肾脏系膜细胞中activin A基因表达的机制研究及其在肾纤维化中的治疗意义

本研究深入探讨了TGFβ1通过转录因子Smad3、Stat5和FoxP1协同调控肾脏系膜细胞中activin A（ActA）基因（inhba）转录的分子机制，揭示了位于启动子区-350bp处的关键调控区域及CT微卫星的抑制作用，为靶向activin A治疗肾纤维化提供了重要理论依据。

　　

引言

慢性肾脏病已成为影响全球10%-13%人口的重大公共卫生问题，其病理特征表现为进行性肾纤维化，最终导致肾功能衰竭。转化生长因子-β1（TGFβ1）被公认为肾纤维化的关键介质，但由于其在维持机体稳态中的多重作用，直接靶向TGFβ1治疗并不可行。近年来，TGFβ家族成员activin A（ActA）作为介导TGFβ1长期促纤维化效应的重要因子受到关注。正常肾脏中几乎不表达的activin A，在多种肾纤维化模型和人类患者中显著上调，且与进行性肾病密切相关。本研究旨在深入解析TGFβ1调控肾脏系膜细胞（MC）中activin A亚基基因（inhba）转录的分子机制，为开发针对activin A的靶向治疗策略提供理论基础。

方法

研究采用原代小鼠肾脏系膜细胞（MC）作为模型系统，通过基因克隆技术构建了包含inhba启动子区域（转录起始位点前2048bp）的荧光素酶报告基因载体及系列缺失突变体。利用MatInspector软件预测转录因子结合位点，并通过位点定向突变、siRNA基因沉默、染色质免疫沉淀（ChIP）和免疫共沉淀等技术验证关键转录因子的功能。细胞培养采用Dulbecco改良培养基（含16%胎牛血清），在37°C、95% O₂和5% CO₂条件下进行。实验还使用了Smad3基因敲除小鼠来源的MC，以及Stat5特异性抑制剂（94 mM）和Smad3抑制剂SIS3（5μM）进行功能验证。

结果

3.1 inhba在肾脏疾病及TGFβ1刺激下表达上调

通过Nephroseq数据库分析发现，慢性肾脏病（CKD）患者肾脏组织中inhba基因表达显著高于正常组织。体外实验证实，TGFβ1（0.5 ng/mL）处理24小时可显著增加MC中inhba转录水平。使用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）的实验进一步证明，TGFβ1对inhba的调控发生在转录水平。

3.2 TGFβ1诱导inhba转录需要转录起始位点附近的调控元件

研究成功克隆了inhba启动子区域，并构建了系列缺失载体（-2048bp至-175bp）。荧光素酶报告基因实验显示，除最短的-175bp构建体外，所有缺失构建体均对TGFβ1刺激产生响应，表明TGFβ1应答关键元件位于-350bp至-175bp区域。

3.3 inhba启动子活性受CT岛微卫星区域调控

有趣的是，-350bp构建体比-437bp构建体对TGFβ1的响应更为显著。序列分析发现在-437bp至-350bp区间存在一个富含胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）重复序列的微卫星区域。该CT微卫星区域对启动子基础活性具有抑制作用，其移除可显著增强启动子活性。

3.4 TGFβ1诱导的inhba启动子活性需要FoxP1和Stat5而非Sox9

通过构建-284bp缺失体发现TGFβ1应答元件位于-350bp至-284bp区间。MatInspector预测该区域存在多个转录因子结合位点。功能研究表明，Sox9基因沉默不影响TGFβ1诱导的启动子激活，而FoxP1和Stat5的 siRNA沉默或结合位点突变均能显著抑制TGFβ1的诱导效应。染色质免疫沉淀实验进一步证实TGFβ1处理可促进FoxP1和Stat5与-350bp启动子区域的直接结合。

3.5 系膜细胞中TGFβ1诱导inhba需要Smad3

尽管在-350bp区域未发现Smad结合元件，但使用Smad3敲除MC和Smad3抑制剂SIS3的实验表明，Smad3对于TGFβ1诱导的全长和-350bp启动子激活均不可或缺。免疫共沉淀实验显示TGFβ1处理可促进Smad3与FoxP1和Stat5的核内相互作用。FoxP1过表达在野生型MC中可剂量依赖性增强启动子活性和activin A蛋白合成，但在Smad3敲除细胞中此效应完全消失。

3.6 FoxP1和Stat5调控inhba的体内证据

采用5/6肾切除慢性肾病模型进行体内验证，免疫荧光染色显示在肾纤维化组织中，FoxP1和Stat5的核定位与activin A表达增加存在显著共定位，特别是在系膜细胞标志物integrin α8阳性区域，为这些转录因子在体内调控activin A提供了支持证据。

讨论

本研究首次系统阐明了TGFβ1通过Smad3、Stat5和FoxP1协同调控肾脏系膜细胞中inhba基因转录的分子机制。发现位于启动子-350bp区域的关键调控元件及其CT微卫星的转录抑制功能，揭示了Smad3虽不直接结合该区域但通过与其他转录因子互作而发挥关键作用的新机制。这些发现不仅深化了对activin A调控网络的理解，也为开发针对肾纤维化的新型治疗策略提供了特异性靶点。由于activin A在正常肾脏中几乎不表达，而在纤维化过程中显著上调，使其成为比TGFβ1更具选择性的治疗靶标，具有重要的临床转化价值。