巨噬细胞Tim-4通过结合CK2β抑制炎症反应保护深静脉血栓形成

本研究发现巨噬细胞Tim-4在深静脉血栓（DVT）中显著下调，其缺失通过增强CK2β/NF-κB通路介导的炎症反应而加剧血栓形成。研究进一步揭示lncRNF219-3:1作为ceRNA海绵吸附miR-93-5p，间接上调Tim-4表达，从而抑制炎症并减轻血栓形成。该研究为DVT的免疫调节机制提供了新见解，并提示Tim-4及其调控网络作为潜在治疗靶点。

引言

深静脉血栓（DVT）是由深静脉血液异常凝固引起的血管疾病，是静脉血栓栓塞（VTE）的主要组成部分，其发病率高且临床后果严重。尽管抗凝疗法广泛应用，但由于过敏和出血等副作用，DVT相关心血管事件仍然频发，因此探索DVT的发病机制以寻找更有效的治疗方法或药物靶点迫在眉睫。

巨噬细胞介导的炎症反应在DVT进展中至关重要。单核细胞衍生的巨噬细胞通过高表达内皮粘附分子（如E-选择素、VCAM-1和ICAM-1）加速血栓形成。此外，活化的巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6等炎症因子，直接诱导组织因子（TF）产生和血管性血友病因子（vWF）依赖性血小板粘附，从而加剧炎症介导的血栓形成。NF-κB信号通路是巨噬细胞中介导炎症反应的重要通路，也是连接巨噬细胞介导的炎症和血栓形成的关键桥梁。

T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含蛋白4（Tim-4）是Tim基因家族的成员，在巨噬细胞和活化的树突状细胞中高表达，而在T细胞中不表达。作为磷脂酰丝氨酸（PS）受体，Tim-4通过结合凋亡细胞表面的PS增强巨噬细胞的吞噬活性，并调节与巨噬细胞相关的细胞因子分泌。研究表明，巨噬细胞Tim-4在多种疾病病理中既可抑制（主要作用）也可增强炎症反应，发挥上下文依赖性作用。然而，Tim-4是否参与DVT相关的炎症反应及其潜在机制尚不清楚。

非编码RNA（ncRNA）通常指基因组编码的一组不翻译成蛋白质的RNA分子，主要包括microRNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA，参与转录调控。miRNA是一类特征明确的ncRNA，通常作为基因表达的转录后调节因子发挥重要作用。miRNA可通过碱基互补配对与靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'UTR）结合，抑制翻译或降解靶基因，从而反向调节靶基因的表达，参与多种疾病的进展。lncRNA是一类长度超过200nt的线性转录本，富含与miRNA互补的序列，称为竞争性内源RNA（ceRNA），作为miRNA的分子海绵发挥作用。通过竞争性结合并阻断miRNA与靶基因之间的互补结合位点，lncRNA可以通过解除miRNA对靶基因的抑制来上调靶基因的表达，并间接参与动脉粥样硬化、高血压和其他血管疾病的发生和发展。

材料与方法

本研究使用巨噬细胞特异性Tim-4敲除小鼠（LysM-Cre; Tim-4^fl/fl）和同窝对照小鼠（Tim-4^fl/fl）来研究巨噬细胞Tim-4在DVT中的作用。通过结扎小鼠下腔静脉（IVC）建立DVT模型。从小鼠腹膜腔和股骨、胫骨中分离原代腹膜巨噬细胞（PEMs）或骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）。使用人巨噬细胞系THP-1和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行体外实验。通过实时定量PCR（qPCR）、Western blot、免疫荧光（IF）、流式细胞术（FCM）和免疫共沉淀（Co-IP）等技术检测基因和蛋白表达。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）验证Tim-4与CK2β的相互作用。通过生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down和RNA反义纯化（RAP）实验验证lncRNF219-3:1/miR-93-5p/Tim-4调控轴。

结果

Tim-4在DVT患者PBMCs和小鼠IVC巨噬细胞中显著降低，而促炎细胞因子升高

分析发现，DVT患者外周血单核细胞（PBMCs）中Tim-4 mRNA表达水平下调，而促炎介质表达上调。KEGG富集分析显示，NF-κB信号通路是DVT患者PBMCs中最显著富集的通路。在DVT小鼠模型中，IVC中Tim-4的mRNA和蛋白水平随时间呈先下降后上升的趋势，与促血栓介质（vWF和TF）的翻译水平以及P65磷酸化（NF-κB通路激活的关键调节因子）的变化趋势相反。单细胞转录组测序分析显示，Tim-4在巨噬细胞中表达最高，且在DVT小鼠巨噬细胞中表达降低。免疫荧光染色结果证实，CD68⁺或F4/80⁺巨噬细胞中Tim-4表达随时间呈先下调后上升的趋势。流式细胞术分析显示，脾脏和腹膜液中F4/80⁺CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G^low巨噬细胞中Tim-4表达也呈现类似趋势。在体外，用DVT患者血清刺激的THP-1和HUVECs共培养系统中，THP-1细胞中Tim-4下调，而IL-1β和TNF-α上调，pP65增加。

巨噬细胞中Tim-4缺失加剧体外和体内血栓形成

在THP-1和HUVECs共培养系统中，沉默Tim-4显著增强HUVECs中vWF、TF和ICAM-1的表达，并增加共培养THP-1细胞中促炎因子（IL-1β和TNF-α）和P65磷酸化。在体内，巨噬细胞特异性Tim-4敲除小鼠表现出增大和增重的血栓和脾脏，血栓横截面积增加和更多炎症灶，脾脏红髓区更多红细胞浸润。Western blot和免疫组化（IHC）检测显示，LysM-Cre; Tim-4^fl/fl小鼠IVC中vWF和TF表达显著升高。qPCR和ELISA检测显示，来自LysM-Cre; Tim-4^fl/fl小鼠的PEMs和BMDMs中促炎因子（IL-1β和TNF-α）表达显著增加，并伴有P65磷酸化水平升高。

巨噬细胞Tim-4通过NF-κB通路减轻炎症诱导的血栓形成

RNA测序分析发现，巨噬细胞中Tim-4敲除显著富集细胞因子介导的炎症反应通路。热图分析显示通路相关差异表达基因上调。Tim-4敲除进一步促进P65磷酸化。体外实验表明，NF-κB抑制剂（BAY11-7082）处理可消除Tim-4敲低依赖的促血栓作用。体内实验表明，BAY11-7082处理显著减轻LysM-Cre; Tim-4^fl/fl小鼠或Tim-4^fl/fl小鼠的血栓形成，并与PEMs和BMDMs中促炎因子（IL-1β和TNF-α）表达降低以及P65和IκBα磷酸化减少相关。

Tim-4通过劫持CK2β抑制NF-κB通路激活

Co-IP联合LC-MS/MS分析鉴定出CK2β（CK2的调节亚基）是Tim-4最显著相互作用的蛋白。ZDOCK刚性蛋白-蛋白对接预测Tim-4和CK2β之间存在稳定的相互作用。Co-IP实验证实内源性Tim-4和CK2β在PEMs中的相互作用，以及外源性表达的HA标记的Tim-4和Flag标记的CK2β在HEK293T细胞中的相互作用。共聚焦实验证明Tim-4和CK2β在PEMs和HEK293T细胞中显著共定位。体外和体内实验表明，CK2抑制剂（CX-4945）处理可消除Tim-4敲低或敲除引起的促血栓表型和NF-κB激活。

miR-93-5p直接靶向并抑制Tim-4表达

生物信息学分析预测miR-93-5p和miR-4313是靶向Tim-4的候选miRNA。由于miR-93-5p在DVT患者PBMCs中表达显著差异，且miR-4313在小鼠中无直系同源物，因此后续研究聚焦于miR-93-5p。荧光素酶报告基因实验显示，miR-93-5p模拟物显著抑制野生型Tim-4 3'UTR的荧光素酶活性，而这种抑制效应在Tim-4 3'UTR突变体中消失。RNA FISH实验证实miR-93-5p主要定位于细胞质。在THP-1和HUVECs共培养系统中，过表达miR-93-5p显著抑制Tim-4表达，同时上调促炎介质（IL-1β、TNF-α）、NF-κB通路组分（P65、IκBα）磷酸化以及miR-93-5p水平，并增强共培养HUVECs中vWF和TF表达。相反，miR-93-5p抑制剂上调Tim-4表达，与THP-1细胞中炎症因子（IL-1β、TNF-α）和NF-κB信号（P65和IκBα磷酸化降低）抑制相关，并减弱共培养HUVECs中vWF和TF产生。挽救实验表明，miR-93-5p抑制的抗炎和抗血栓效应被同时的Tim-4敲低所逆转，证明Tim-4是miR-93-5p介导的炎症激活和血栓形成的关键下游效应器。

LncRNF219-3:1通过海绵吸附miR-93-5p间接上调Tim-4

通过整合生物信息学方法构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，鉴定出lncRNF219-3:1（NONHSAT166973.1）作为miR-93-5p/Tim-4轴的潜在调节因子。qPCR分析、RNA FISH和lncLocator预测数据库证实lncRNF219-3:1在THP-1细胞中主要定位于细胞质。编码潜力评估工具显示lncRNF219-3:1具有极低的编码潜力，强烈表明其是一个主要的候选lncRNA。荧光素酶报告基因实验表明，miR-93-5p模拟物显著抑制lncRNF219-3:1-WT报告基因活性，而这种效应在lncRNF219-3:1-MUT中完全消失，证实了直接结合位点。RNA pull-down和RAP实验证明lncRNF219-3:1和miR-93-5p之间存在直接物理关联。在THP-1和HUVECs共培养系统中，过表达lncRNF219-3:1显著增加Tim-4表达，同时降低炎症因子（IL-1β、TNF-α）和P65/IκBα磷酸化，并减少共培养HUVECs中促血栓标志物（vWF和TF）。相反，lncRNF219-3:1敲低在THP-1和共培养HUVECs中引起相反效应。相互挽救实验表明，共转染pclncRNF219-3:1和miR-93-5p模拟物完全消除lncRNF219-3:1诱导的Tim-4上调，并逆转其对IL-1β、TNF-α、pP65和pIκBα的抑制效应，以及共培养HUVECs中促血栓标志物（vWF、TF）的抑制效应。相反，lncRNF219-3:1敲低表型被miR-93-5p抑制所逆转，建立了一个线性的lncRNF219-3:1/miR-93-5p/Tim-4调控级联。

临床验证DVT患者队列中Tim-4及相关通路靶点的表达谱

临床样本分析显示，与健康对照相比，DVT标本中Tim-4和lncRNF219-3:1表达显著降低，而miR-93-5p水平和促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α）显著升高。免疫荧光染色结果显示，与无血栓血管相比，DVT患者腘静脉段CD68⁺巨噬细胞中Tim-4表达显著降低，而CD68⁺巨噬细胞中CK2β水平无变化，Tim-4/CK2β共定位在血栓段显著减少。

讨论

本研究首次描述了急性DVT发病过程中下静脉壁Tim-4表达的单细胞转录组谱分析。分析揭示Tim-4在 murine DVT模型的组织巨噬细胞和DVT患者的循环PBMCs中显著下调，表明其全身性参与血栓形成过程。机制上，巨噬细胞特异性Tim-4缺失通过破坏其与CK2β的物理相互作用加剧炎症反应，从而激活NF-κB信号并增强血栓形成。重要的是，我们鉴定了一个新的调控lncRNF219-3:1/miR-93-5p轴作为通过ceRNA介导的机制抑制巨噬细胞中Tim-4的关键上游调节因子。这些发现通过以下方面显著推进了我们对DVT病理生理学的理解：（1）确立Tim-4作为血栓性疾病的关键调节因子和潜在治疗靶点；（2）阐明了DVT中先前未被认识的Tim-4/CK2β相互作用机制和ncRNA依赖性调控电路。

结论

总之，我们的研究确定巨噬细胞Tim-4是一个通过选择性劫持CK2β抑制DVT发展的关键负调节因子。机制上，我们证明巨噬细胞特异性Tim-4缺失破坏其与CK2β的结合，从而释放CK2依赖性激活NF-κB信号通路，并升高下游促炎基因表达，最终加剧巨噬细胞炎症反应诱导的DVT进展。此外，我们发现了一个新的调控轴，负责DVT中Tim-4下调表达：由lncRNF219-3:1/miR-93-5p轴介导的ceRNA网络。基于这些发现，我们描绘了巨噬细胞中一个新的Tim-4/CK2β/NF-κB信号通路，由lncRNF219-3:1/miR-93-5p轴调节。这些发现不仅为DVT的分子发病机制提供了新的见解，而且突出了临床DVT治疗的潜在治疗靶点。