土拉弗朗西斯菌入侵红细胞机制：Band 3-GcvT-PdpC互作网络的发现与功能解析

本研究揭示了土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）通过Band 3/Ankyrin/Spectrin复合体入侵红细胞的新型机制。研究发现红细胞膜蛋白Band 3是细菌入侵的关键受体，其胞质域与细菌糖氨酸裂解酶T（GcvT）直接互作；而T6SS效应蛋白PdpC与血影蛋白α链（Spectrin α）结合，首次建立了细菌分泌系统与红细胞骨架的直接功能联系。该发现为人兽共患病 tularemia 的传播机制提供了重要理论依据。

　　

1 引言

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是一种革兰阴性兼性胞内致病菌，可引起人兽共患病土拉热（tularemia）。该菌能入侵哺乳动物红细胞，这一现象显著增强其在吸血节肢动物（如蜱虫）中的定植能力，进而促进向哺乳动物宿主的传播和环境持久性。红细胞与常规吞噬细胞不同，其完全缺乏内吞降解途径，且细胞骨架由独特的血影蛋白（Spectrin）网络构成，通过Band 3/锚蛋白（Ankyrin）复合体和4.1R复合体锚定于细胞膜。本研究旨在阐明土拉弗朗西斯菌入侵红细胞过程中关键的宿主-病原体相互作用。

2 材料与方法

研究采用土拉弗朗西斯菌LVS株系及突变体，在含0.1% L-半胱氨酸的胰蛋白酶大豆肉汤（TSBc）或Chamberlain化学限定培养基（CDM）中培养。人红细胞通过密度梯度离心从全血中分离。通过庆大霉素保护实验评估细菌入侵效率，使用抗Band 3和抗血型糖蛋白A（Glycophorin A, GPA）的Fab2片段进行受体阻断实验。构建表达Band 3胞质域（CDB3）的重组质粒pCDB3和pCDB3-emGFP，通过免疫共沉淀（Co-IP）和GFP亲和下拉实验鉴定互作蛋白。采用蛋白质组学技术（LC-MS/MS）分析互作蛋白组分，并通过基因缺失突变体验证功能。

3 结果

3.1 Band 3是红细胞入侵的关键宿主受体

用抗Band 3 Fab2片段处理红细胞可显著抑制土拉弗朗西斯菌入侵，而Fc片段无影响。细菌与重组Band 3蛋白预孵育后，入侵能力明显下降，表明Band 3作为功能性受体介导细菌入侵。

3.2 血型糖蛋白A（GPA）意外抑制入侵

抗GPA Fab2片段处理红细胞后，细菌入侵反而增强，提示GPA可能通过空间阻遏或构象调控抑制Band 3的受体功能，这一现象与疟原虫等病原体利用GPA作为受体的机制截然不同。

3.3 锚蛋白-1（Ankyrin-1）是入侵必需因子

从Ankyrin-1缺陷型（nb/nb）小鼠分离的红细胞显示入侵效率显著降低，证实Band 3/Ankyrin复合体在细菌入侵中起核心作用。该结果与此前发现的spectrin损伤抑制入侵的现象一致。

3.4 GcvT与Band 3胞质域互作并促进入侵

通过Co-IP和下拉实验，发现土拉弗朗西斯菌的糖氨酸裂解酶T（Glycine Cleavage Protein T, GcvT）与Band 3胞质域特异性结合。gcvT缺失突变体入侵能力显著下降，回补后表型恢复，证明GcvT是通过Band 3互作介导入侵的关键细菌因子。

3.5 T6SS效应蛋白PdpC直接结合血影蛋白α链

免疫共沉淀实验证实，细菌效应蛋白PdpC与红细胞骨架蛋白血影蛋白α链（Spectrin α）直接相互作用。该发现首次将细菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）效应物与红细胞骨架重构直接关联，揭示了入侵机制的分子基础。

4 讨论

本研究系统阐明了土拉弗朗西斯菌入侵红细胞的分子机制：细菌通过GcvT与Band 3胞质域结合，同时效应蛋白PdpC靶向血影蛋白α链，协同调控红细胞骨架重构以促进入侵。Band 3/GPA/Ankyrin复合体作为核心宿主枢纽，其中GPA发挥意外抑制作用，而Ankyrin-1和spectrin为正向调控因子。该机制不同于疟原虫等病原体的入侵策略，凸显了土拉弗朗西斯菌独特的宿主适应机制。未来研究需进一步验证GcvT的分泌途径及PdpC-spectrin互作的结构基础，为干预人兽共患病传播提供新靶点。

研究全部采用体外实验模型，虽使用减毒LVS株，但其入侵效率与强毒株Schu S4相当，保证了结论的可靠性。发现的宿主-病原体互作网络为理解胞内病原体跨界感染提供了范式参考。