基于嘌呤霉素的蛋白合成速率评估揭示胰岛驻留免疫细胞代谢谱及其在糖尿病中的意义

本文推荐一种基于嘌呤霉素（Puromycin）的流式细胞术方法（SCENITH），用于单细胞水平分析胰岛驻留免疫细胞（如巨噬细胞和T细胞）的代谢表型与蛋白合成（PS）速率。该方法通过糖酵解抑制剂2-DG和线粒体ATP合酶抑制剂Oligomycin揭示细胞能量依赖途径，为糖尿病中β细胞功能障碍和免疫代谢互作提供新见解。

　　

引言

胰腺胰岛中的免疫细胞（包括淋巴细胞和巨噬细胞）在维持胰岛稳态、促进β细胞发育和组织修复中发挥关键作用。然而，在糖尿病等病理状态下，这些细胞可引发炎症反应，导致β细胞功能障碍和死亡。近年来，研究者对β细胞与驻留免疫细胞之间的动态相互作用日益关注。但由于胰岛细胞群体混杂且细胞数量有限，传统代谢组学和细胞外通量分析等技术难以应用于此类稀有细胞群体的代谢研究。

材料与方法

本研究采用基于嘌呤霉素（Puromycin）的流式细胞术 assay（SCENITH），平行分析胰岛驻留免疫细胞的表型和代谢状态。从健康小鼠分离的胰岛经细胞因子混合物（IL-1β、TNF-α、IFN-γ）处理以模拟促炎性糖尿病微环境。实验中使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）和线粒体复合物V抑制剂寡霉素（Oligomycin）干扰能量代谢，并通过短时孵育嘌呤霉素后使用荧光标记抗嘌呤霉素抗体检测蛋白合成速率。此外，通过链脲佐菌素（STZ）诱导β细胞死亡模型，并在骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和MIN6β细胞系中验证该方法。

结果

小鼠与人β细胞中嘌呤霉素掺入评估

在基础状态下，β细胞的蛋白合成主要依赖线粒体来源的ATP。寡霉素处理显著降低puromycin MFI（平均荧光强度），而2-DG处理未产生明显影响，表明β细胞在非葡萄糖刺激条件下优先依靠线粒体呼吸供能。

嘌呤霉素 assay 在β细胞代谢谱验证中的应用

促炎细胞因子处理并未改变β细胞对寡霉素的敏感性。MIN6细胞和原代β细胞在细胞外通量分析中均显示：2-DG不影响氧消耗速率（OCR），而寡霉素显著降低OCR，进一步证实线粒体ATP耦合呼吸在β细胞中的主导地位。

胰岛驻留巨噬细胞的代谢特征分析

经IL-4极化的BMDMs（M(IL-4)）显示高CD301表达和高基础蛋白合成速率，且对寡霉素敏感；而经IFN-γ和LPS极化的巨噬细胞（M(IFNγ+LPS)）高表达CD86，OCR低下且对寡霉素无反应。在细胞因子处理的胰岛巨噬细胞中，CD86⁺群体表现出更高的基础puromycin掺入率和同时对2-DG与寡霉素的敏感性，提示其糖酵解和线粒体代谢途径均活跃。

β细胞死亡对胰岛细胞代谢特征的影响

STZ诱导的β细胞毒性导致胰岛素^high细胞减少和胰岛素^low细胞积累。胰岛素^low细胞对2-DG处理更为敏感，蛋白合成速率显著降低，表明其对糖酵解的依赖性增强。同时，STZ处理促进胰岛中巨噬细胞（F4/80⁺）和CD3⁺ T细胞聚集，并提高CD86⁺巨噬细胞比例及其对寡霉素的敏感性。

讨论

本研究成功将SCENITH原理应用于胰岛驻留免疫细胞的单细胞代谢分析，克服了细胞数量少和群体异质性带来的技术限制。该方法通过药理抑制特定代谢途径（糖酵解与氧化磷酸化）并结合蛋白合成读数，为理解糖尿病中免疫-代谢交叉对话提供了有力工具。未来可进一步应用于干细胞衍生胰岛的代谢评估，助力细胞替代疗法的优化。

局限性

部分实验因胰岛产量限制未包含2-DG+寡霉素（DGO）及 cycloheximide 对照组；人胰岛实验仅来自单一供体，统计效力有限。通过合并多只小鼠的胰岛或增加样本量可优化实验设计。