综述：巨噬细胞可塑性的个体发育特征与表观遗传调控

本综述深入探讨了巨噬细胞功能多样性的核心机制，系统阐述了其个体发育起源（Ontogeny）、环境信号与表观遗传重编程（Epigenetic reprogramming）如何协同调控细胞可塑性。文章强调了超越传统M1/M2范式的研究策略，并介绍了前沿原位多组学技术（如NuTRAP、TurboID），为靶向巨噬细胞相关疾病（如肿瘤、代谢性肝病）的治疗开发提供新视角。

　　

Introduction

巨噬细胞在哺乳动物组织中广泛分布，不仅在生理状态下维持稳态，还在病理过程中调控疾病进展。尽管经典的M1/M2极化分类为研究提供了基础框架，但这一模型显著简化了巨噬细胞的真实可塑性与异质性。结合谱系追踪与多组学分析的新进展，揭示了巨噬细胞功能分化的新机制。本综述聚焦于个体发育、环境信号、遗传及表观遗传因素如何通过表观遗传重编程共同驱动巨噬细胞可塑性，并重点介绍了能够在原生组织微环境中研究巨噬细胞的尖端原位分析技术。

巨噬细胞以其卓越的功能和表型多样性著称，在不同组织中具有特化身份：大脑中称为小胶质细胞（microglia），肝脏中为Kupffer细胞，骨骼中则为破骨细胞（osteoclasts）。尽管存在组织特异性适应，所有巨噬细胞均表达CD68、IBA-1和F4/80（小鼠特异性）等标志物，并具备维持组织稳态所必需的吞噬活性。

其发育起源亦具独特性：不同于多数免疫细胞，巨噬细胞可源自胚胎祖细胞，而非依赖于骨髓造血。这些胚胎来源的群体在稳态条件下通过自我更新维持，极少由循环单核细胞补充；但在损伤或炎症过程中，单核细胞浸润组织并分化为功能性巨噬细胞。值得注意的是，巨噬细胞在终末分化后仍保持可塑性，例如经气管移植的巨噬细胞可在肺中获肺泡巨噬细胞样特征，凸显其适应新微环境的非凡能力。

Macrophage specification through nature and nurture factors

巨噬细胞特化的“先天”（个体发育）与“后天”（环境信号）贡献长期存在争议。环境主导性的例证包括：移植至肺泡气腔的小鼠腹膜巨噬细胞上调肺泡巨噬细胞特异性基因；在Kupffer细胞缺损的肝脏中，重建的单核来源巨噬细胞在基因表达谱上与定居Kupffer细胞趋同。然而，这些细胞无法表达Kupffer细胞身份标志物Timd4，提示个体发育约束的存在。类似地，造血干细胞来源的祖细胞在补充小胶质细胞缺损后不表达Sall1，进一步强调谱系特异性因子在骨髓来源前体中的不可或缺性。

区分个体发育效应与环境信号的关键在于识别顺式作用调控DNA序列（如启动子元件与增强子）及反式作用调控蛋白（如响应环境信号的信号转导蛋白）。利用小鼠品系特异性单核苷酸多态性（SNP）作为体内诱变筛选工具，研究发现巨噬细胞谱系决定转录因子（LDTF）PU.1和C/EBPα在调控区域的结合模式具品系特异性，且与邻近基因表达改变相关。CRISPR基因组编辑技术使得直接验证这些顺式元件的功能成为可能：删除Sall1启动子互作的超级增强子可特异性消除小胶质细胞中Sall1表达，并严重损害其对TGFβ–SMAD信号轴的响应性。

环境或生态位因子的重要性延伸至急性缺损模型之外的炎症性疾病（如肝炎与癌症）。炎症信号不仅招募血液单核细胞，还诱导巨噬细胞的深度表观遗传重编程，驱动其表型与功能可塑性。这些环境反式调控蛋白与LDTF协同作用：在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中，核受体LXRα（由Kupffer细胞身份基因Nr1h3编码）与ATF3合作上调Trem2和Cd9表达，促使Kupffer细胞向单核来源巨噬细胞样状态转变。

个体发育与环境信号并非孤立运作，其整合使巨噬细胞在维持组织稳态的同时适应外部刺激。LDTF作为桥接个体发育程序与环境响应的关键介质，定义了巨噬细胞的功能特化。识别生理与病理条件下的情境特异性LDTF，并绘制其DNA结合位点（顺式调控元件）与互作核伙伴（反式调控蛋白），将为这一动态过程提供机制性见解。

Genetic and epigenetic factors drive macrophage plasticity

肿瘤主要在恶性细胞中积累突变以维持失控生长，但体细胞突变亦见于非恶性细胞，尤其在年龄相关病变中。造血干祖细胞（HSPC）中的突变导致意义未明的克隆性造血（CHIP），约75%的CHIP变异影响三个表观遗传调控因子之一：DNMT3A（参与DNA CpG甲基化）、TET2（介导DNA去甲基化与组蛋白去乙酰酶招募）及ASXL1（促进H3K27三甲基化的Polycomb抑制复合体组分）。CHIP与多种病理相关，包括肾损伤、糖尿病、心血管疾病与癌症。例如，一项针对421名非小细胞肺癌患者的临床研究显示，42%携带CHIP突变；其中TET2突变不仅与肿瘤相关巨噬细胞数量增加相关，还增强其免疫抑制表型。这些基因的功能缺失突变似乎解除表观遗传抑制，驱动巨噬细胞可塑性，从而桥接遗传改变与表观遗传失调。

超越CHIP介导的可塑性，代谢重编程是巨噬细胞功能适应的另一关键调节器。细胞代谢与巨噬细胞极化的联系已获确立，尤其于M1/M2范式中：活性氮氧物种驱动M1极化。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是主要的葡萄糖消耗者， fueling糖酵解与三羧酸循环（TCA）活性。TCA循环中间产物作为关键表观遗传调控剂：琥珀酸与富马酸调节DNA甲基化（通过改变5-mC/5-hmC比率）与组蛋白甲基化（尤其于H3K9、H3K27与H3K36），而乙酰-CoA直接调控组蛋白乙酰化状态。这些代谢-表观遗传交叉点为环境信号塑造巨噬细胞可塑性提供了机制基础。

表观遗传重编程（包括染色质重塑与组蛋白修饰）在细胞适应性中起核心作用。基因表达启动前，增强子与启动子区域必须首先可及，而这在异染色质紧密包裹时颇具挑战。染色质重塑剂调控核小体定位与解压缩， enabling转录因子结合。该过程与组蛋白尾部的翻译后修饰（如乙酰化、甲基化与磷酸化）紧密相连：H3K27ac标记转录活跃区域，而H3K27me3促进异染色质形成与基因沉默。

近期工作揭示，双价H3K27修饰（乙酰化 vs. 三甲基化）相互排斥，并在肝脏恶性肿瘤（包括转移与肝细胞癌）中 critical调控Kupffer细胞的表型可塑性。在健康肝组织中，H3K27ac维持Kupffer细胞身份基因（Timd4、Clec4f、Id3）表达；肿瘤浸润后，H3K27me3取代这些基因位点的H3K27ac，而H3K27ac转移至免疫抑制基因增强子（如Spp1、Trem2），将Kupffer细胞从抗肿瘤重编程为促肿瘤效应器。值得注意的是，Spp1与Trem2在正常Kupffer细胞中即呈现开放染色质，提示组蛋白修饰切换作为快速表观遗传重编程机制驱动功能可塑性。然而，谱系特异性因子如何与环境因子协作驱动表观遗传重编程仍不清楚，需进一步研究。

In situtools for probing macrophage plasticity

传统巨噬细胞可塑性研究依赖于体外分化模型，其中骨髓来源细胞与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）及其他细胞因子共育以诱导极化。这些模型在阐明训练免疫现象中尤为有价值：先天免疫细胞通过表观遗传重编程（以特征性组蛋白修饰与染色质可及性改变为证据）与代谢重连，对次级刺激发展出增强响应性。尽管体外表观遗传分析提供了训练免疫的机制见解，这些模型过度简化了复杂组织环境，其中多种信号协同塑造巨噬细胞功能。

另一常见方法涉及酶解组织分离，随后以荧光抗体标记巨噬细胞并进行流式细胞分选（FACS）。然而，机械/酶解消化与FACS均施加细胞应激，可能改变巨噬细胞状态并引入功能分析误差。

为克服这些限制，原位方法（于原生组织环境中分析细胞）已成为强大替代方案。核心原理是在组织破坏前预标记细胞组分（如核、RNA或蛋白质），随后进行分子富集而非全细胞分离。该策略保留生理背景的同时 enabling巨噬细胞身份与活性的精确表征。

用于特定群体原位核分析，研究人员可采用两种NuTRAP小鼠模型，分别荧光标记核膜或组蛋白。这些工具通过染色质可及性 assay（ATAC-seq）、组蛋白修饰分析（CUT&Tag）与转录因子结合分析（CUT&RUN）实现全面表观遗传表征。快速组织裂解后，分离核经甲醛固定以维持原生表观遗传状态。荧光标记核可经FACS分选，达成细胞特异性分辨率的下游表观遗传分析。

对于RNA预标记，两种主要方法可用：将硫尿嘧啶核糖核苷酸掺入新合成RNA，或免疫沉淀与活性翻译mRNA结合的核糖体。第一方法中，尿嘧啶类似物4-硫尿嘧啶经寄生虫来源的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）转化为硫尿苷单磷酸（thio-UMP）并掺入新生RNA。通过工程化小鼠以细胞特异性方式表达UPRT，4-硫尿嘧啶掺入可限制于目标群体。标记RNA可通过生物素化或烷基化捕获方法分离。第二方法更直接，利用细胞特异性表达GFP标记核糖体（翻译核糖体亲和纯化）。GFP免疫沉淀 enabling与这些核糖体关联的活性翻译mRNA富集，提供细胞特异性翻译活性分析的直接方法。

研究蛋白-蛋白互作（PPI）面临显著挑战，尤其在体内，许多互作短暂或微弱。为此，研究人员 engineered快速标记动力学的突变生物素连接酶，包括TurboID（已适配小鼠脑研究）。此模型中，TurboID表达限制于星形胶质细胞， enabling这些细胞内蛋白质的特异性生物素化。组织裂解后，生物素化蛋白可经免疫沉淀纯化用于下游分析。重要的是，该策略可扩展至巨噬细胞特化研究，通过靶向TurboID表达于内源巨噬细胞谱系因子，从而 enabling原生情境中巨噬细胞特异性PPI的精确分析。

Discussion

理解巨噬细胞可塑性与异质性对于开发多种疾病的靶向治疗至关重要。传统M1/M2分类虽提供基础框架，却未能捕捉巨噬细胞功能状态的多维性与动态性。本综述强调了解读巨噬细胞功能时考虑个体发育印迹的重要性， evidenced by胚胎来源与单核补充巨噬细胞在组织稳态中的功能差异。反之，在疾病背景（尤其炎症）中，生态位因子驱动环境重编程，直接改变组织定居巨噬细胞或促进单核细胞在炎症组织中的招募与分化。重要的是，个体发育程序与环境信号并非孤立运作，其通过动态表观遗传机制相互作用塑造巨噬细胞行为。新兴证据强调增强子景观重编程在这一过程中的 pivotal作用，这些表观遗传修饰的特征化为巨噬细胞调控提供新见解。

我们提出，整合谱系信息与表观遗传分析为 deciphering巨噬细胞功能提供更全面途径。当前方法如单细胞RNA测序（scRNA-seq），无论是否结合FACS，均产生有价值数据但需大量组织处理。这些程序破坏原生微环境并诱导细胞应激，可能模糊基质对巨噬细胞行为的关键影响。

为克服这些限制，我们倡导互补使用新兴原位技术。这些尖端工具 enabling巨噬细胞于原生组织情境中的 investigation，保留关键细胞互作与微环境信号。其应用有望 yield巨噬细胞生物学新见解，同时克服传统分离方法的相关误差。