基于小RNA测序揭示金银花通过miRNA调控网络缓解脂多糖诱导泥鳅炎症反应的分子机制

本研究通过小RNA测序技术系统解析了金银花提取物通过调控miRNA表达网络（如let-7家族成员和animal-mir-21-6等关键miRNA），介导鞘脂信号通路（Sphingolipid signaling）、甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）和TNF信号通路（TNF signaling）等关键通路，从而抑制脂多糖（LPS）诱导的泥鳅炎症反应的分子机制，为中药免疫调控机制提供了新的分子进化见解。

　　

1 引言

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）作为鳅科底栖鱼类，广泛分布于亚洲淡水生态系统，是中国淡水养殖业的重要高价值物种。其不仅富含优质蛋白质、维生素和必需氨基酸，还具有卓越的环境适应性，能够耐受高温（>30°C）、低氧和间歇性干旱等极端条件。近年研究发现，泥鳅组织中的生物活性成分（如黏液多糖和抗氧化酶）具有抗炎、保肝和抗肿瘤潜力，推动其从传统食用向药用应用转变。然而，集约化养殖常面临病原微生物感染（如嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda）和环境胁迫（如氨氮积累）引发的炎症性疾病暴发，严重威胁养殖生产力和行业可持续性。

脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌外膜主要成分，通过激活Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路触发鱼类系统性炎症，导致促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）过度产生。金银花（Lonicera japonica）作为传统中药，含木犀草素（LUT）、绿原酸和咖啡酸等生物活性化合物，具有广谱抗炎、免疫调节和抗氧化特性。既往研究表明金银花提取物通过抑制TLR4通路缓解哺乳动物炎症损伤，但其对鱼类LPS诱导炎症的调控作用尚未探索。

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码RNA（长度约22 nt），通过结合靶mRNA的3'非翻译区（UTR）调控基因表达，在免疫应答和细胞稳态中起关键作用。自1993年在秀丽隐杆线虫中发现首个miRNA（lin-4）以来，高通量测序技术已在斑马鱼（Danio rerio）等模式鱼类中鉴定出数百个保守miRNA。近期进展进一步凸显了miRNA在非模式养殖物种应激适应和抗病性中的关键功能，为解析抗病原机制提供了新见解。

尽管现有研究关注泥鳅免疫，但中药干预LPS诱导炎症反应的分子机制仍不清楚。本研究首创性地整合小RNA测序和分子生物学方法，系统分析LPS攻击和金银花处理后泥鳅肌肉组织的miRNA表达谱，有助于深入理解金银花的抗炎机制，从而为优化泥鳅人工养殖方法提供基础。

2 材料与方法

2.1 实验动物与LPS处理

从浙江省水生动物育种基地购买300条体型相近的健康泥鳅，随机分为6组，每组平均50条。正常投喂3天，每日20克饲料。第四天起，三组添加中草药粉末（20克饲料+10克中草药）作为实验组，另三组同等量正常投喂作为对照组。12小时后，对照组和处理组每条泥鳅腹腔注射100 μL LPS溶液（60 mg/100 μL，溶于磷酸盐缓冲盐水PBS）。PBS配制方法：8.00 g NaCl、0.20 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄和0.24 g KH₂PO₄溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节pH至7.4，定容至1升。分别在3、6、12和24小时观察两组样本。取肝脏组织研磨后液氮速冻，-80°C保存。

2.2 总RNA提取与cDNA文库构建

使用Trizol试剂提取总RNA，经DNase I（无RNase）处理去除基因组DNA污染。通过NanoDrop 2000分光光度计评估RNA纯度和浓度，Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性。筛选标准：28S/18S rRNA比率≥1.0、RNA完整性指数（RIN）≥7.0、OD_260/280=1.8-2.2、OD_260/230≥2.0。为富集小RNA分子（18-30 nt），使用15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行大小选择。纯化后的小RNA用T4 RNA连接酶连接3'和5'接头，通过接头特异性引物进行逆转录，PCR扩增生成cDNA文库。经3.5%琼脂糖凝胶电泳纯化目标大小片段（140-160 bp），去除未掺入引物、引物二聚体和接头污染物。最终cDNA文库经qPCR定量，在Illumina HiSeq平台进行双端测序（PE150）。

使用上海派森诺生物科技有限公司自主开发脚本去除原始序列接头，按测序质量进行质控修剪。具体以5碱基长度为窗口扫描，当窗口内平均测序质量低于20时，截断并丢弃前端部分。获得过滤序列（clean reads），统计长度大于18 nt且小于36 nt的Clean Reads数量（Total Reads）。对单样本内相同序列去重复并计数丰度，获得Unique Reads用于后续分析。

2.3 小RNA注释

使用Blast将Unique Reads与Rfam13数据库比对，筛选rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA四类已知ncRNA，筛选标准为完美匹配或错配不超过2处。

未注释到上述四类ncRNA的Reads与miRBase22数据库所有成熟miRNA序列比对鉴定保守miRNA，标准为完美匹配或错配数不超过2。

汇总小RNA与其他类型RNA的比对注释结果。因小RNA序列短易匹配不同片段，存在多重注释，按已知miRNA > rRNA > tRNA > snRNA > snoRNA > novel miRNA优先级排序确保唯一注释。同时分析已知miRNA的碱基偏好性。

2.4 差异表达miRNA分析

将泥鳅miRNA与miRBase数据库相关物种成熟miRNA序列Blast比对，根据保守miRNA序列数计算Reads Count值。整理对照组和处理组保守miRNA表达数据，使用DESeq分析表达差异miRNA。主要按表达倍数差异（|fold change| > 2）和差异显著性（p-value < 0.05）筛选，最终统计结果。为判断差异表达基因在不同实验条件下的表达模式，使用R语言Pheatmap软件包对基因和样本进行双向聚类分析，采用欧几里得距离计算和完全连接法进行层次聚类。

2.5 miRNA靶基因预测与功能分析

因miRNA主要通过互补配对结合靶位点，使用miranda预测动物miRNA靶基因，psRobot_tar预测植物miRNA靶基因。对差异miRNA靶基因进行GO功能富集分析，获得显著富集的GO功能项，显示相关生物学功能。将所有基因映射到Gene Ontology数据库各Term，计算每个Term的靶基因数量，使用超几何分布检验靶基因相对全基因组背景的显著富集Term。统计各KEGG Pathway不同层级包含的靶基因数量，确定靶基因主要涉及的代谢通路和信号通路（使用超几何分布检验靶基因相对全基因组背景的显著富集通路）。

2.6 实时定量PCR验证

根据│log₂(fc)│>1和fpkm > 10原则选择7个基因（5个下调和2个上调）进行验证，用DNAstar设计引物。采用SYBR^? Green Supermix法进行qPCR验证，引物长度标准为18-24 bp。

3 结果

3.1 小RNA测序结果分析

为研究病原感染和金银花处理下泥鳅miRNA表达动态，从实验组（金银花投喂）和对照组肝脏组织提取总RNA，构建六个独立小RNA测序文库。深度测序产生1.447亿条原始读段。经严格质控（包括接头修剪、污染读段去除和低质量序列消除），保留1.396亿条高质量clean reads。所有文库中高质量clean reads比例均超过95.6%。对18-36 nt高质量clean reads（total reads）进行长度分布分析，去重复后丰度分析显示小RNA主要富集在21-23 nt范围，22 nt序列占比最高。该分布模式符合动物miRNA典型特征，证实测序数据的生物学相关性。

3.2 泥鳅肝脏组织miRNA鉴定

感染组和对照组clean reads系统分类注释为已知RNA、未注释RNA和非编码RNA（ncRNA，包括rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA）。生物信息分析显示，去重复后clean reads中已知RNA比例介于4%-8%之间，而去重复前超过68%。去重复后已知RNA丰度显著降低（从>68%降至<10%），表明miRNA富集过程中有效去除了冗余转录片段。

已知miRNA碱基偏好性分析发现5'端具有强烈U倾向，即Dicer酶和DCL酶识别切割前体miRNA引起的典型miRNA碱基比例。通过miRNA碱基偏好分析获得典型miRNA碱基比率。

3.3 差异表达miRNA鉴定

通过比对进化保守miRNA，量化实验组间miRNA读段计数。比较分析显示，与金银花处理组相比，感染组中animal-let-7-9、animal-let-7-6和animal-let-7-18显著上调。相反，金银花干预后animal-let-7-1、animal-let-7-17和animal-let-7-16呈现显著转录激活，倍数变化值超过2.5。这些差异表达模式表明let-7 miRNA家族具有病原响应和植物治疗调控作用。

比较LJ组和CK组miRNA表达差异，发现55个差异表达基因（41个显著上调和14个显著下调）。所有miRNA在LJ组和CK组的表达谱显示于热图中。值得注意的是，这些差异表达miRNA中，animal-undef-351、animal-mir-21-6和animal-undef-603表达差异最显著（P<0.01）。同时发现animal-mir-22-2、animal-mir-181-4、animal-mir-122-2、animal-mir-454-2、animal-mir-10-13、animal-mir-29-11和animal-mir-129-3在所有miRNA中均呈现下调趋势，表明这些miRNA转录水平可能受LJ中共同因子调控。

3.4 miRNA预测靶基因的GO和KEGG通路富集分析

本实验共预测91,596个靶基因，其中150个miRNA具有靶基因。同时一个靶基因可能对应多个靶位点，故共预测913,690个靶位点。GO富集中选择前10个生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）目录。生物过程类别中，多数注释靶点涉及糖基化和糖蛋白生物合成过程。细胞组分类别中，多数靶点分配于转录调节复合物和细胞内膜结合细胞器。分子功能类别中，多数靶点与双链DNA结合和转录顺式调节区域结合相关。

基因本体（GO）富集分析显示功能类别间 distinct 层次模式：生物过程（BP）：从泛素依赖性内吞作用（GO:0048497）经大分子修饰（GO:0043412）至蛋白质糖基化（GO:0006486）的功能连贯层次显著富集，表明翻译后修饰通路系统激活。细胞组分（CC）：膜结合细胞器（GO:0043227）与其子术语细胞内膜结合细胞器（GO:0043231）间的父子关系显示显著富集，突出区室特异性调控机制。分子功能（MF）：DNA结合（GO:0003677）和细胞外囊泡生物发生（GO:0140115）内富集GO术语，表明基因组完整性维持和细胞间通讯过程的协调调控。

此外，KEGG富集分析发现参与细胞识别和信号转导的鞘脂信号通路和甘油磷脂代谢，以及参与抗炎信号通路的T细胞受体信号通路和TNF信号通路。

3.5 选定miRNA的qRT-PCR一致性验证

为进一步验证RNA-seq鉴定的差异表达miRNA，采用qRT-PCR确认。选择7个miRNA（animal-undef-180、animal-undef-459、animal-mir-122-2、animal-mir-181-4、animal-mir-22-2、animal-mir-29-11和animal-undef-334）进行qRT-PCR，发现与对照组相比，2个上调基因和5个下调基因呈现相同调控趋势。这表明差异表达miRNA的表达模式与实时PCR检测结果一致。

4 讨论

泥鳅作为中国重要淡水养殖物种，面临炎症相关疾病带来的可持续生产挑战。提升其生长性能和抗病力仍是养殖优化重点。金银花含生物活性化合物（如绿原酸和木犀草苷），具有抗炎、免疫调节和抗菌特性。既往LPS诱导急性肺损伤（ALI）小鼠模型研究表明，金银花提取物通过调节NF-κB通路显著抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6），同时提高存活率。然而，中药在水生物种免疫调节的分子机制仍探索不足。因此，本研究整合L攻击和金银花膳食干预实验设计，系统表征miRNA表达动态。

本研究通过测序技术鉴定20,349,467-25,283,783条clean reads，clean read比率超过95%，确认数据完整性 robust，符合后续生物信息分析测序质量基准。六组clean reads长度分布18-30 bp，主要21-23 bp，最聚集于22 bp，符合Dicer衍生物典型序列长度分布。

整合嗜水气单胞菌感染和金银花处理泥鳅组小RNA测序数据，鉴定55个差异表达miRNA（DEM），包括41个上调和14个下调物种。值得注意的是，数个DEM既往涉及炎症调控和肌肉发育：miR-21、miR-29、mir-142和miR-122被差异调节。具体地，miR-21通过ROCK1依赖性occludin表达上调保护肠道紧密连接（TJ）屏障完整性，其敲除加剧屏障功能障碍和炎症级联。嗜水气单胞菌感染草鱼中，miR-142通过直接靶向TNFAIP-2和GLUT-3发挥抗凋亡和抗炎作用。而miR-122通过抑制IL-6、IL-15和IL-1β减轻嗜水气单胞菌诱导炎症，但同时破坏TJ屏障蛋白（occludin、claudin-2、claudin-5）和EGFR信号，加剧胃肠道高通透性和继发炎症。Castleman病患者狭窄黏膜区miR-29显著下调表明其抑制病理性增生驱动炎症。这些发现共同表明金银花干预可能通过协调DEM表达网络（如miR-21/miR-142）抑制促炎级联并优化肌生成通路，缓解泥鳅炎症表型和提升肌肉质量。

KEGG通路富集分析显示差异表达miRNA（DEM）靶基因显著富集四个关键信号通路：鞘脂信号、甘油磷脂代谢、T细胞受体（TCR）信号和TNF信号。作为脂代谢核心调节器，鞘脂和甘油磷脂通路通过生物活性脂介质（如鞘氨醇-1-磷酸S1P和溶血磷脂酸LPA）协调细胞增殖、凋亡、应激响应和炎症级联。药理学证据表明天麻素和没食子酸通过上调S1P受体1（S1PR1）表达改善鞘脂失调，从而抑制促炎细胞因子（如IL-1β和TNF-α）。同时，甘油磷脂代谢扰动提升系统性炎症标志物（如CRP、IL-6），与代谢紊乱进展相关。TCR通路通过调节性T细胞（Tregs）分泌IL-10强化免疫耐受，有效抑制过度炎症。而TNF-α作为TNF通路关键效应物，通过NF-κB和MAPK激活驱动炎症级联。值得注意的是，中药干预减弱这些通路以减轻炎症损伤。GO富集分析显示多数差异表达基因显著富集于糖基化生物过程、转录调节复合物细胞组分和双链DNA结合分子功能——这些均关键参与炎症调控。我们提出糖基化修饰通过调节转录因子稳定性和促进转录凝聚物形成调控炎症通路（如NF-κB）。此外，双链DNA结合蛋白功能活性受其糖基化状态影响，而转录凝聚物组装依赖于DNA支架。这三种机制通过基因表达、染色质重塑和信号转导级联的协调调控协同 orchestrate 炎症消退。整合KEGG和GO证据表明，金银花膳食干预通过多靶点调节脂代谢重编程、免疫耐受建立和表观遗传重塑，在泥鳅中发挥协同抗炎效应。

5 结论

本研究基于miRNA转录组测序技术，探究了LPS介导金银花对泥鳅免疫功能影响机制。结果表明金银花对泥鳅免疫功能具有一定调节作用。本研究为金银花合理利用提供新思路，为泥鳅健康养殖提供理论指导。