GlyT1抑制剂ALX-5407通过抑制Th1分化协同雷帕霉素减轻同种异体移植排斥反应

本研究发现，在Th1极化CD4+T细胞中，甘氨酸转运体1（GlyT1/SLC6A9）表达显著上调。其特异性抑制剂ALX-5407通过诱导caspase-3介导的凋亡并下调BCL-2，有效抑制Th1分化（减少IFN-γ+CD4+T细胞比例及CD25/CD69表达）。虽然单药无效，但ALX-5407与雷帕霉素联用可协同抑制MAPK并拮抗PI3K-AKT-mTOR通路反馈激活，显著延长小鼠皮肤及心脏移植物存活（p=0.018），为临床移植免疫治疗提供新策略。

　　

1 引言

移植排斥仍是移植物丢失的主要原因，其中T辅助1（Th1）细胞驱动的免疫反应起核心作用。活化的T细胞经历代谢重编程，增强糖酵解和线粒体氧化磷酸化以满足生物能量需求，这一代谢可塑性为靶向治疗提供了潜在突破口。甘氨酸作为多效性代谢枢纽，具有显著抗炎和抗凋亡特性：它通过一碳循环驱动细胞增殖和表观遗传重编程，同时作为谷胱甘肽（GSH）生物合成的必需底物清除活性氧（ROS），减轻氧化应激。在移植排斥背景下，CD4⁺ Th1细胞的高代谢活性使其对细胞内甘氨酸浓度变化异常敏感。

溶质载体（SLC）转运蛋白家族在T细胞代谢适应中日益受到关注。其中，SLC6A9（GlyT1）编码钠/氯依赖性甘氨酸转运体1，主要调控甘氨酸跨膜流动，并参与线粒体甘氨酸代谢。ALX-5407作为一种高效且高度选择性的GlyT1抑制剂，可减少甘氨酸内流，导致细胞外甘氨酸积累。基于甘氨酸在CD4⁺T细胞功能中的关键作用，本研究提出假设：GlyT1抑制可能调控CD4⁺T细胞活化状态，从而减轻移植排斥。

2 材料与方法

2.1 T细胞分离与极化

从C57BL/6小鼠脾脏中通过磁珠阴性分选分离CD4⁺T细胞，在抗CD3?预包被的96孔板中于Th1极化条件下培养（含IL-2、IL-12p70、抗IL-4及抗CD28）。添加0.5–500 nM ALX-5407或载体对照，培养72小时后进行流式细胞术或RNA测序分析。

2.2 小鼠皮肤移植模型

将BALB/c供体小鼠的全层尾部皮肤移植至C57BL/6受体小鼠背部。术后每日腹腔注射ALX-5407（100 mg/kg）、雷帕霉素（50 mg/kg）或载体（每组n=5），监测移植物存活情况，定义>90%坏死为排斥。收集存活移植物及次级淋巴器官进行组织病理学和免疫学分析。

2.3 小鼠心脏移植模型

取BALB/c小鼠心脏，将其主动脉和肺动脉分别套接入C57BL/6受体小鼠的颈动脉和颈静脉。术后每日评估移植心搏动情况，绘制生存曲线。

2.4 流式细胞术

对体外培养细胞或受体脾脏单细胞悬液进行表面标志物（Live/Dead、CD4、CD8α、CD25、CD44、CD69等）和细胞内细胞因子（IFN-γ、IL-17A、Foxp3）染色。用PMA/离子霉素刺激6小时（加入布雷菲德菌素A）后进行细胞因子检测。数据在BD LSR Fortessa X-20上获取，用FlowJo v10.8分析。

2.5 qRT-PCR

使用TRIzol试剂提取RNA，反转录为cDNA后，在LightCycler^? 96系统上进行qPCR，以GAPDH为内参，用2^(-ΔΔCt)法计算基因相对表达量。

2.6 H&E染色和免疫荧光

移植皮肤或心脏经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后行H&E染色。CD4免疫荧光染色采用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，用抗CD4一抗（1:100）和Alexa Fluor 488标记二抗（1:500）孵育，DAPI复染核。

2.7 CFSE增殖实验和体内CTV增殖实验

CFSE标记的CD4⁺T细胞用不同浓度ALX-5407处理72小时后，通过流式检测增殖。体内实验则用CellTrace? Violet（CTV）标记CD4⁺T细胞，活化后静脉输注至C57BL/6小鼠，腹腔注射ALX-5407（50 mg/kg/日）或对照，3天后取脾脏流式分析CD4⁺CTV⁺细胞增殖。

2.8 RNA测序

Th0和Th1极化细胞经ALX-5407（500 nM）或载体处理24小时后提取RNA，建库测序。用DESeq2识别差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG通路富集分析。

2.9 Western blotting

细胞裂解液经BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳并转膜。用5%脱脂牛奶封闭后，孵育一抗和二抗，ECL发光检测信号，ImageJ v1.53定量。

2.10 统计分析

数据以均值±标准差表示，用GraphPad Prism v10.0分析。多组比较采用双因素ANOVA及Bonferroni事后检验，组间比较用非配对t检验。移植物存活率用Kaplan-Meier法及log-rank检验分析，p<0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 SLC6A9（GlyT1）在Th1细胞中高表达

RNA测序显示Th0和Th1细胞转录组谱存在明显差异。在溶质载体（SLC）家族中，SLC6A9（GlyT1）表达在Th1细胞中显著高于Th0细胞（p<0.05），表明GlyT1介导的甘氨酸调控可能影响Th1增殖和分化。

3.2 ALX-5407不影响CD4⁺T细胞体内外增殖，但影响CD4⁺Th1细胞的分化和功能

ALX-5407在0.5-500 nM浓度下对Th1细胞增殖影响甚微，但500 nM时细胞活力开始下降。体内实验同样显示，ALX-5407对CD4⁺T细胞增殖无显著影响。然而，流式细胞术分析表明，ALX-5407处理组中CD4⁺IFN-γ⁺T细胞比例显著降低，IFN-γ平均荧光强度（MFI）也明显下降。同时，CD25和CD69的MFI值降低，表明T细胞活化受抑。细胞因子mRNA表达水平分析一致显示Ifng表达下调，Il1β和Il10上调，Tgfb1无变化。这些结果提示，ALX-5407显著抑制Th1分化并削弱Th1细胞活化与功能。

3.3 ALX-5407与雷帕霉素协同延长同种移植物存活

小鼠皮肤移植模型中，ALX-5407单药治疗未能延长移植物存活，但与雷帕霉素联用后生存期显著延长（p=0.018）。术后第7天组织学评估显示，联合治疗组移植物结构保存更好，炎症浸润减少。免疫荧光分析进一步证实，联合组移植物内CD4⁺T细胞浸润显著少于其他各组。

在心脏移植模型中，ALX-5407治疗组移植心存活时间较对照组显著延长（p=0.0020）。术后第7天病理分析显示，ALX-5407治疗组移植心结构完整性改善，炎症细胞浸润明显减轻。

3.4 ALX-5407通过调节脾脏免疫反应减轻Th1驱动的排斥

对皮肤移植后第7天小鼠脾细胞进行流式分析发现，各组间脾细胞活力、CD4⁺/CD8⁺T细胞比例无显著差异。但所有治疗组CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺T细胞比例均低于对照组，其中联合组降低最明显。联合治疗还显著降低了CD4⁺和CD8⁺T细胞中活化标志（CD25、CD44、CD69）的MFI值。调节性T细胞（Tregs）和Th17细胞无显著组间差异。B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和髓源性抑制细胞等更广泛的免疫群体也未出现治疗相关改变。这些数据表明，ALX-5407与雷帕霉素的抗排斥功效主要源于对Th1分化和功能活性的协同抑制。

3.5 ALX-5407通过诱导凋亡抑制Th1细胞分化

对ALX-5407处理的Th1细胞进行RNA测序及KEGG/GO富集分析发现，PI3K-AKT-mTOR通路上调而MAPK通路下调，Western blot验证了这一结果。鉴于这两条通路在凋亡调控中的关键作用，检测发现ALX-5407处理组细胞凋亡显著增加。Western blot证实cleaved caspase-3水平升高，抗凋亡蛋白BCL-2表达降低。这些发现提示ALX-5407通过诱导细胞凋亡减少Th1细胞数量。

值得注意的是，PI3K-AKT-mTOR通路激活促进T细胞增殖和分化，这可能是ALX-5407单药疗效有限的原因。ALX-5407与mTOR抑制剂雷帕霉素联用，部分抵消了ALX-5407引起的mTOR通路反馈激活，从而协同增强了对Th1的抑制（1+1>2效应）。

4 讨论

溶质载体（SLC）超家族包含超过65个亚家族（SLC1-SLC65）和400多个成员，作为离子、代谢物和药物的跨膜转运体，具有保守结构特征。CD4⁺Th1细胞在移植排斥中起关键作用，其在活化和Th1分化时经历代谢重编程，代谢活性增强。SLC家族蛋白深入参与这些过程，是T细胞调控的有前景的治疗靶点。

GlyT1（SLC6A9）主要在神经元细胞表达，调节神经元胞体和突触间隙的甘氨酸浓度，并已被探索用于神经精神疾病治疗。其在CD4⁺T细胞生物学中的作用尚不清楚。我们的RNA-seq分析显示，在Th0向Th1分化过程中GlyT1显著上调，是所筛查SLC成员中表达变化最显著的，从而将其确定为本研究的焦点。

甘氨酸作为多功能代谢枢纽，其细胞内耗竭减少一碳单位可用性，从而限制S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生物合成。这种缺乏产生双重后果：（1）提供嘌呤环形成所需的C4/C5/N7原子减少，损害胸苷酸合成，耗尽DNA复制底物，最终导致细胞周期停滞和增殖能力下降；（2）甲基供体供应受损直接破坏谱系特异性转录程序（Tbx21位点组蛋白修饰减弱），改变CD4⁺T细胞的表观遗传调控。同时，甘氨酸缺乏抑制谷胱甘肽（GSH）生物合成，促进CD4⁺T细胞中线粒体活性氧（ROS）积累。分化细胞内固有的低抗氧化能力随后触发凋亡。实验性GlyT1抑制重现了这一病理生理过程，降低细胞内甘氨酸，导致：caspase-3升高、BCL-2抑制、CD4⁺T细胞凋亡增加和Th1分化受损。这些发现证实了甘氨酸在CD4⁺ T细胞代谢中的关键作用，并表明靶向其代谢流可诱导功能重编程。值得注意的是，在移植模型中，GlyT1抑制显著降低了脾脏CD8⁺ T细胞中IFN-γ的产生——一种关键的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应分子——表明平行机制可能减轻同种移植物损伤，提示ALX-5407具有更广泛的免疫调节潜力。

然而，与先前报道不同，CD4⁺T细胞增殖未受影响。RNA-seq分析揭示了补偿性PI3K-mTOR过度激活驱动糖酵解增强以维持增殖。但这种代谢适应同时增加了ROS生成并抑制了GSH合成，最终激活了ROS-BCL-2轴，通过失败的稳态适应建立了“持续增殖伴随加速凋亡”的矛盾表型。

目前的常规免疫抑制方案，包括糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂（CNIs）、霉酚酸酯（MMF）和mTOR抑制剂，具有显著的细胞毒性和强效免疫抑制作用，增加了恶性肿瘤、感染和全身毒性的风险。这强调需要辅助性免疫抑制剂，既降低细胞毒性，又能增强常规疗法同时保持抗排斥功效。我们的研究结果表明，ALX-5407单药治疗在小鼠皮肤移植模型中与对照组相比仅略微延长移植物存活，但无统计学意义（p>0.05）。鉴于ALX-5407在体外抑制Th1分化，我们研究了其与雷帕霉素的联合使用。联合方案与任一单药相比显著延长了同种移植物存活（p=0.018），并伴随脾脏组织中Th1细胞比例和移植物中CD4⁺ T细胞浸润的抑制。这种协同效应提示ALX-5407和雷帕霉素相互增强。机制分析显示，ALX-5407单药治疗诱导了矛盾的PI3K-Akt-mTOR通路上调，该通路是CD4⁺T细胞增殖/分化的关键促进因子，这可能解释了其有限的 standalone 疗效。关键是，雷帕霉素共同给药抑制了这种mTOR的反馈激活，为增强的抗排斥效应提供了合理的机制。这种治疗策略通过通路互补性建立了开发辅助免疫抑制剂的新范式。

我们的初步证据表明ALX-5407可能部分通过诱导凋亡抑制Th1分化。未来研究将阐明其精确分子靶点，并通过基于机制的工程优化其抗排斥功效。

5 结论

GlyT1是Th1分化过程中的一个代谢检查点。用ALX-5407靶向GlyT1可减少Th1极化并延长同种移植物存活，可能通过诱导凋亡实现。这些发现将ALX-5407定位为一种新型免疫调节剂，值得在移植排斥的联合治疗中进一步开发。