细胞内自组装纳米针实现高效溶酶体逃逸及CRISPR/Cas9介导的基因编辑

本文推荐一篇创新性研究，开发了一种基于细菌膜载体（PlaMnB）的CRISPR/Cas9递送系统。该系统利用肿瘤细胞内金属离子诱导质粒自组装形成纳米针结构，突破溶酶体逃逸瓶颈，并通过端粒酶逆转录酶（TERT）启动子实现肿瘤特异性基因编辑，为精准基因治疗提供了新策略。

　　

1 引言

基因编辑技术CRISPR/Cas9系统的精准递送是避免正常细胞非靶向编辑的关键。尽管已有多种载体被开发用于递送CRISPR/Cas9系统，但生物屏障和递送工具的不足仍是主要限制。溶酶体滞留是体内CRISPR/Cas9递送的主要生物屏障，因为溶酶体含有多种水解酶和酸性环境，能快速降解递送的有效载荷。为克服溶酶体滞留障碍，已开发多种策略，包括使用带正电材料作为药物载体以破坏带负电的溶酶体膜、利用膜融合肽通过构象变化与溶酶体膜融合实现逃逸、通过光敏剂产生的活性氧（ROS）破坏溶酶体膜完整性，以及利用自组装可变形纳米材料的机械性能物理破坏溶酶体完整性。除溶酶体滞留外，CRISPR/Cas9的另一挑战是由于非预期基因编辑引起的安全问题。为减轻基因毒性风险和意外基因组改变，对CRISPR/Cas9活性的精确时空控制至关重要。各种"智能"靶向递送载体已被提出，用于将CRISPR/Cas9系统特异性递送到预期部位并避免对正常细胞的潜在脱靶干扰。合成生物学提供了功能性启动子工具，可响应温度、光和酶等信号永久或温和地调节特定基因模块的时空表达。CRISPR/Cas9系统通常以Cas9蛋白和sgRNA复合物、编码Cas9蛋白和sgRNA的mRNA以及表达Cas9蛋白和sgRNA的DNA形式递送。其中，基于DNA的递送可能是最简单的选择，因为其尺寸小、体内稳定性高，且具有持续有效的基因编辑效果。特别是质粒形式的DNA可用于响应外部刺激以受控方式在基因水平调节Cas9和gRNA的表达，但很少在CRISPR/Cas9递送系统中探索。

2 结果与讨论

2.1 金属诱导的细胞内自组装纳米针形成

研究发现金属离子可诱导质粒自组装成纳米针形态，直径60-90纳米，长度几微米，当Mn²⁺与质粒的摩尔比在5×10⁴:1至5×10⁵:1范围内时形成纳米针，而其他比例形成纳米颗粒。通过透射电子显微镜（TEM）观察，金属离子在摩尔比10⁵:1下20分钟内即可驱动质粒快速自组装。高分辨率TEM显示多个小颗粒，可能对应于纳米针转变早期的缩合质粒。SYBR荧光标记实验表明，当金属离子与质粒摩尔比达到1×10⁶:1时，荧光信号强度显著降低，归因于质粒与Mn²⁺配位形成纳米针过程中SYBR荧光团的猝灭。当纳米针浸入10 mM腺苷三磷酸（ATP）时，荧光强度增加，表明ATP竞争性结合Mn²⁺诱导纳米针结构解离。圆二色光谱（CD）和紫外光谱（UV）分析显示，质粒与Mn²⁺相互作用导致碱基堆叠和金属配位，表明双链结构解旋趋势。原子力显微镜（AFM）测量显示纳米针的弹性模量为4.87 GPa，显著高于纳米颗粒的0.33 GPa，机械强度增加15倍对溶酶体逃逸至关重要。质粒纳米针在超声处理10分钟或pH 5条件下形态稳定。其他二价阳离子如Mg²⁺和Ca²⁺也可诱导质粒组装成纳米针。质粒与金属离子自组装成纳米针的机制主要由两个关键相互作用支配：Mn²⁺离子与质粒DNA核碱基杂原子形成配位复合物，以及金属离子与DNA骨架磷酸基团的静电相互作用。

2.2 PlaMnB的制备与表征

使用从大肠杆菌BL21(DE3)提取的细胞膜作为递送载体，该载体经基因工程改造，含有胞溶素A-肿瘤归巢肽（ClyA-THP）质粒，用于增强通透性和肿瘤靶向。PCR、SDS-PAGE和Western blot验证了ClyA-THP-EGFP蛋白在细菌和膜上的成功表达。工程化细菌膜显示对癌症细胞（MCF-7、CT-26、A549）的摄取显著高于正常细胞（NIH-3T3），归因于肿瘤归巢肽与肿瘤细胞表面特异性受体的结合相互作用。为增强质粒在肿瘤中的特异性递送和表达，将MnO₂与CRISPR/Cas9编码质粒一起封装在细菌膜中，利用酸性还原性溶酶体微环境中MnO₂释放的Mn²⁺诱导质粒组装成纳米针结构并破坏溶酶体膜。X射线衍射（XRD）和TEM确认了MnO₂的成功合成。元素映射显示PlaMnB含有Mn元素（来自MnO₂）和P元素（来自质粒或膜）。细菌膜也用于封装质粒和MgSiO₃或SiO₂，形成的纳米颗粒分别称为PlaMgB或PlaSiB。包封效率随膜含量增加而增加，膜含量20 μg时包封效率为55.12%。质粒和MnO₂的直径分别约为1.5 nm和63 nm，而PlaMnB的平均直径增加至82.6 nm。PlaMnB在10%胎牛血清（FBS）中5天内尺寸无显著变化，显示良好稳定性。

2.3 质粒纳米针结构穿刺溶酶体膜

溶酶体滞留是治疗剂高效细胞内递送的主要障碍，推测具有高机械强度的质粒配位针可促进溶酶体逃逸。通过体外溶酶体模型（脂质体封装不同配方）和Calcein AM荧光指示剂验证，含质粒和金属离子的组别显示荧光值显著增加，表明纳米针结构可破坏脂质体膜。TEM图像显示，含质粒和MnO₂的脂质体在还原条件下处理后呈现纳米针结构并伴随脂质体结构破坏。溶血实验证实纳米针具有损伤细胞膜的能力。细胞水平实验使用吖啶橙（AO）染色显示，PlaMgB和PlaMnB处理组几乎无红色荧光，表明溶酶体完整性被破坏。流式细胞术分析一致显示较低红色荧光强度。PlaSiB对照组未诱导溶酶体逃逸，表明金属离子在诱导质粒形成和后续溶酶体破坏中起关键作用。使用溶酶体追踪剂的共聚焦显微镜图像显示，PlaMgB或PlaMnB处理组中红色和绿色斑点明显分离，证明成功溶酶体逃逸和SYBR染料扩散到细胞核。生物电子显微镜（Bio-EM）显示PlaMnB处理细胞在溶酶体内外呈现纤维结构，进一步证实金属离子在质粒丝化过程中的关键作用。

2.4 含TERT嵌入和CRISPR/Cas9编码质粒的PlaMnB体外抗肿瘤效果

CRISPR/Cas9系统的挑战之一是因在不需要的位置进行基因编辑而导致的脱靶效应。为解决这一问题， incorporated特异性启动子作为开启开关，调节可被ROS、温度或特定组织环境激活的基因表达。利用人TERT启动子在大多数肿瘤细胞中特异性高表达的特点，将其纳入CRISPR/Cas9表达质粒中调节Cas9/sgRNA表达，实现抗癌基因编辑。TERT-EGFP质粒作为CRSIPR/Cas9质粒替代物转染各种细胞系，在四种癌症细胞系（MCF-7、A549、Caco-2、Raji）中观察到显著绿色荧光信号，而在非癌细胞系（HEK-293T、NIH-3T3）中未检测到绿色荧光信号。Western blot分析显示，非癌细胞系中Cas9表达水平显著低于癌细胞系。这些数据证明TERT启动子可驱动CRISPR/Cas9系统的特异性表达，作为最小化脱靶效应的直接有效工具。接下来评估PlaMnB对MCF-7细胞的体外杀伤效果。使用PlaMnB递送Cas9和PLK-1 sgRNA表达质粒（ resulting纳米颗粒称为PlaMnB-PLK-1），通过靶向PLK-1基因研究杀伤效果。细胞摄取实验显示SYBR标记的PlaMnB在MCF-7细胞中12小时达到饱和。MCF-7细胞可被TERT-Cas9-sgRNA(PLK-1)-EGFP质粒以剂量依赖性方式杀死。PlaMnB-PLK-1组存活率最低（约8%），而PlaB-PLK-1组存活率约41%，表明纳米针结构促进PlaMnB从溶酶体逃逸到细胞质和细胞核，增强CRISPR/Cas9系统的基因治疗效