基因工程猪角膜内皮细胞生物相容性研究：年龄与基因修饰对角膜异种移植成功的关键影响

本刊推荐：本研究系统评估了多重基因编辑（TKO/QKO结合hCD55/hCD39等人源基因插入）猪角膜内皮细胞的生物物理相容性。研究发现，6月龄以上基因工程猪角膜内皮细胞密度损失率（8.8%）显著低于幼龄组（55.1%），且屏障功能蛋白（ZO-1、N-cadherin）及泵通道（ATPase、AQP1、SLC4A11）表达完整。值得注意的是，hTBM基因插入可能导致早期内皮细胞凋亡。研究为筛选临床级角膜异种移植供体提供了关键功能学依据。

　　

引言

角膜异种移植的概念最早由Franz Riesinger于1824年提出，旨在用透明动物角膜替代混浊人角膜。尽管首例猪-人角膜移植尝试早于同种异体移植数十年，但异种免疫反应曾是难以逾越的障碍。随着基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的发展，α1,3-半乳糖基转移酶敲除（GT-KO）猪显著降低了超急性排斥反应，使猪器官移植进入临床探索阶段。东亚地区因文化宗教因素面临角膜供体短缺，而基因工程猪成为潜在解决方案。既往研究表明，单/双基因编辑猪角膜未能显著延长移植物存活，需依赖强效免疫抑制剂。因此，评估多重免疫相关基因编辑后角膜内皮细胞功能是否受损至关重要。

材料与方法

研究使用三重（TKO）或四重（QKO）基因敲除猪模型，靶向α1,3-半乳糖基转移酶（GGTA1）、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）、β1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶（β4GalNT2）及异球蛋白三己糖苷酰鞘氨醇合成酶（iGB3s）基因，并结合人源基因（hCD55、hCD39、hCD46、hTBM）插入。共采集14头基因工程猪的27个眼球，评估物理参数和功能特性。角膜内皮细胞密度（ECD）在保存液（Optisol GS）中连续监测7天，计算细胞倍增时间（DT），并通过免疫荧光染色分析泵通道（ATPase、水通道蛋白1、SLC4A11）和紧密连接蛋白（ZO-1、N-钙黏蛋白）表达。

结果

物理与光学特性

基因工程猪平均年龄为11.9个月，平均中央角膜厚度为718.2μm。6月龄以下猪角膜内皮细胞损失率高达55.1%，而6月龄以上仅8.8%（p<0.001）。T(Q)KO/hCD46/hTBM组角膜出现早期严重内皮细胞凋亡或坏死，其他组未见此现象。角膜直径和屈光度与已成功用于非人灵长类移植的SNU小型猪角膜相当。

内皮细胞密度动态变化

年轻组（<6月龄）初始ECD较高（>5400 cells/mm²），但7天内损失显著（38.9%-61.7%）；年长组（≥6月龄）ECD稳定（损失率10.5%-11.1%），与人类角膜保存数据（7.6%）接近。T(Q)KO/hCD46/hTBM组表现最差，损失率达61.7%。

细胞增殖能力

所有组别角膜内皮细胞均具增殖能力，但基因工程猪倍增时间（72.2-139.0小时）长于SNU小型猪（50.5-54.9小时）。年龄对倍增时间无显著影响（p>0.05）。

内皮细胞功能完整性

免疫荧光染色显示，所有组别的屏障蛋白（ZO-1、N-钙黏蛋白）和泵通道（ATPase、水通道蛋白1、SLC4A11）均正常表达，提示基因编辑未损害内皮细胞核心功能。

讨论

本研究首次系统评估多重基因编辑猪角膜内皮细胞的生物物理相容性。6月龄以上T(Q)KO/hCD55/hCD39和QKO猪角膜在厚度、光学特性及ECD稳定性方面均满足移植要求。年轻供体角膜虽初始ECD高，但快速凋亡可能引发炎症级联反应，加剧异种免疫应答。值得注意的是，hTBM基因插入可能导致类似Fuchs角膜内皮营养不良的病变，提示其不适用于全层角膜移植。研究局限性包括样本量少和年龄分布不均，但为筛选临床候选供体提供了关键功能学依据。

结论

基因工程猪角膜内皮细胞功能未受多重免疫基因编辑影响，但供体年龄至关重要。6月龄以上T(Q)KO/hCD55/hCD39和QKO猪角膜具备生物相容性优势，而含hTBM基因型及幼龄供体应排除于临床移植候选名单。