酶法辅助提取希腊犬蔷薇假果生物活性化合物的优化及其抗氧化、抗菌与抗糖尿病活性研究

本研究推荐一种绿色高效的酶辅助提取（EAE）技术，利用Pectinex? Ultra Color（果胶酶）与Viscoferm?（半纤维素酶）协同作用，从希腊犬蔷薇（Rosa canina L.）假果中优化提取生物活性化合物。通过Box-Behnken设计（BBD）优化工艺参数，显著提升总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）及抗氧化活性（IC50），并证实提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及大肠杆菌生长的生物活性，为天然产物在食品、医药领域的应用提供新策略。

　　

材料与方法

研究采用希腊北部栽培的犬蔷薇（Rosa canina L.）假果（玫瑰果）为原料，经干燥、去籽、粉碎后过筛（粒径<500 μm）备用。主要试剂包括DPPH、甲醇、Folin-Ciocalteu试剂（Sigma-Aldly），酶制剂Pectinex? Ultra Color（果胶酶）和Viscoferm?（半纤维素酶）由Novozymes A/S赠送。实验设计采用三因素三水平Box-Behnken设计（BBD），自变量为提取时间（60–180 min）、Pectinex?加载量（0.25–0.75% v/v）和Viscoferm?加载量（0.50–1.00% v/v），响应变量为总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和抗氧化活性（IC₅₀）。

酶辅助提取在50°C、pH 5.5的磷酸缓冲液中进行，固液比6% w/v，振荡速度1300 rpm。反应后离心收集上清，85°C加热10 min灭酶，保存于-18°C。TPC测定采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸当量（GAE）表示；TFC采用铝氯化物比色法，以儿茶素当量（CAE）表示；抗氧化活性通过DPPH自由基清除能力测定，以IC₅₀（μL_extract/mL）表示。生物学活性评估包括：酪氨酸酶抑制（抗衰老）、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制（抗糖尿病）以及大肠杆菌抗菌活性。

结果与讨论

TPC提取优化

TPC值范围115.2–127.1 mg GAE/g DW，最优条件为提取时间96.23 min、Pectinex? 0.59% v/v、Viscoferm? 0.51% v/v，预测TPC 122.42 mg GAE/g DW，实验验证值为123.22±2.50 mg GAE/g DW。模型分析显示Viscoferm?加载量对TPC影响最显著，但高浓度双酶协同使用会降低酚类释放，表明需精细调控酶比例。响应面分析表明，高Pectinex?加载量与较长提取时间组合可最大化TPC产出，原因可能是果胶酶特异性降解细胞壁多糖（如α-1,4-糖苷键），促进酚类溶出。

TFC提取优化

TFC范围42.3–49.7 mg CAE/g DW，最优条件下载量为46.34 mg CAE/g DW，实验值49.13±0.92 mg CAE/g DW。Pectinex?加载量是主要驱动因素，而Viscoferm?影响较小。二次模型显示酶间存在拮抗效应，高浓度双酶使用反降低黄酮得率。表面图显示，Pectinex?高于0.65% v/v与提取时间>120 min时TFC最高，说明果胶酶在黄酮释放中起主导作用。

抗氧化活性

抗氧化活性IC₅₀范围0.71–1.23 μL_extract/mL，越低活性越强。最优条件下IC₅₀预测0.99，实验值0.98±0.02 μL_extract/mL。Viscoferm?加载量对抗氧化活性影响最大，但长时间提取或高酶量可能导致抗氧化成分降解。模型指出，0.75% v/v Viscoferm?与0.25% v/v Pectinex?组合在90 min时活性最强，说明半纤维素酶可能释放小分子酚类增强抗氧化能力。

生物学活性评估

抗糖尿病活性方面，提取物对α-淀粉酶抑制较弱（IC₅₀=97.95 mg/mL），对α-葡萄糖苷酶抑制中等（IC₅₀=7.50 mg/mL），显著优于常规溶剂提取。抗衰老活性（酪氨酸酶抑制）较弱（IC₅₀=65.77 mg/mL），不及阳性对照曲酸。抗菌试验显示，提取物对大肠杆菌生长抑制率达55.1%，表明其具 moderate 抗菌潜力。活性差异可能与酚类结构（如羟基化、糖基化）及共存多糖的基质效应有关。

结论

酶辅助提取（EAE）结合BBD优化可高效回收犬蔷薇假果中的生物活性化合物，提升TPC、TFC和抗氧化活性。双酶协同在温和条件下实现绿色提取，提取物展示出抗糖尿病、抗菌及 moderate 抗衰老活性，为开发功能性食品和药物提供了可持续策略。未来研究应聚焦活性成分鉴定与工艺定向优化。