单分子水平定量解析TDP-43蛋白聚集体纳米结构特征揭示运动神经元病特异性分子指纹

本刊推荐：本研究运用单分子下拉技术（SiMPull）结合超分辨显微镜（dSTORM）和蛋白质组学，首次在单粒子水平实现对运动神经元病（MND）患者脑组织中TDP-43聚集体的定量表征。研究发现疾病特异性聚集体具有更长尺寸、更高纤维化程度和更低抗体标记密度的纳米特征，并能通过线性判别分析（LDA）区分不同临床亚型。该技术为开发微创诊断和疾病监测工具提供了新范式。

　　

引言

异常蛋白质聚集是慢性神经退行性疾病的核心分子特征。在运动神经元病（MND）中，97%的病例会出现TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的不溶性沉积。TDP-43是一种高度保守的核蛋白，在RNA转录、剪接和核质运输中起关键作用。在MND患者神经元中，TDP-43被异常翻译后修饰的大型不溶性聚集体滞留在细胞质中。虽然TDP-43突变是MND的罕见病因，但数十年来研究尚未明确聚集体在疾病病理和进展中的具体作用。

现有检测方法存在明显局限：免疫组织化学和免疫荧光技术虽能定量TDP-43的细胞和宏观分布，但不适用于量化可能先于大型不溶性沉积形成的小型可溶性组装体，而这些组装体已被证实与疾病病理相关。冷冻电镜虽能提供TDP-43聚集体的超微结构细节，但由于需要粒子平均化，其在量化罕见亚群方面存在严重限制。因此，迫切需要开发能同时量化和表征人源复杂样品中多聚TDP-43组装体异质性的新方法。

单分子显微技术为量化表征纳米级多聚组装体提供了独特优势。本研究报道了单分子下拉（SiMPull）技术与亲和蛋白质组学的结合应用，实现对MND患者死后脑组织中TDP-43组装体的定量表征和异质性分析。

结果

单分子下拉技术特异性表征TDP-43聚集体组装体

为检测TDP-43的多聚组装体，研究采用单分子下拉技术（SiMPull）。该技术类似于夹心ELISA平台，使用固定在功能化玻璃盖玻片上的抗体从溶液中捕获目标物，然后通过第二个荧光标记抗体进行检测。使用相同单克隆抗体进行靶标的捕获和检测，确保捕获的粒子至少包含两个相同表位，从而排除单体蛋白。通过全内反射荧光显微镜（TIRF）量化荧光信号，目标分子数量可直接读数为衍射限制荧光斑点数量。

研究选用识别TDP-43 203-209残基区域的抗体（flTDP），该抗体能够检测与MND相关的全长和截短TDP-43亚型。通过使用重组TDP-43 RRM1和RRM2结构域（一个易聚集片段）验证了SiMPull对多聚体而非单体的选择性。硫黄素T荧光监测显示该片段存在浓度依赖性聚集。使用聚集前后（"Before"，0小时；"After"，72小时）采集的样品进行flTDP-SiMPull分析，发现聚集后样品中可见荧光斑点数量显著增加。量化硫黄素T或flTDP抗体荧光显示的斑点数量，发现聚集后样品中组装体数量显著更多。

通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）这一超分辨技术（分辨率20纳米）测定聚集前后捕获组装体的尺寸分布。测量了聚集前后样品中超过3500个独立聚集体，发现聚集后样品中含有更高比例的长聚集体。这些数据共同证实所选SiMPull配置为捕获和表征TDP-43多聚组装体提供了灵敏特异的方法。

TDP-43阳性组装体并非疾病独有

为评估疾病来源脑组织中的多聚TDP-43组装体，研究纳入了10例个体，包括5例观察到TDP-43病理的MND供体（MND_TDP）和5例对照供体。对照队列包括3例神经学正常供体和2例诊断家族性SOD1-MND（MND_SOD）的疾病对照供体。SOD1和TDP-43的病理聚集通常被认为是互斥的，但有趣的是，研究结果提示可能存在例外。

对每位供体获取匹配的额叶皮层（BA9；MND中以晚期TDP-43病理为特征）和小脑（通常不显示TDP-43病理）组织进行分析，共形成20个样品进行表征。每个组织样品首先在人工脑脊液介质中浸泡，然后均质化。这种方法能够表征可能有助于向邻近细胞或体内传播的可扩散蛋白组装体，以及通常保留在组织内的嵌入组装体，为了解这些亚群的分布和物理化学特性提供见解。

衍射限制SiMPull在所有三个测试队列的可扩散和嵌入提取物中均检测到TDP-43阳性组装体。当使用聚集体特异性化学抗体（CAP1）耗尽样品中的聚集体后，通过SiMPull检测到的TDP-43阳性组装体数量减少至背景水平，表明这些组装体本质主要是聚集体。

有趣的是，在MND_TDP来源的小脑提取物中鉴定出显著更多的TDP-43阳性组装体。相比之下，MND_TDP来源的额叶皮层含有较神经学正常对照组更少的TDP-43阳性组装体。当将flTDP捕获抗体替换为CAP1进行SiMPull时，这一现象同样出现，再次支持从组织提取物中捕获的组装体主要是可溶性纳米级聚集体的断言。

除了丰度，还分析了单个斑点的强度作为聚集体尺寸的伪测量。虽然额叶皮层提取物中对照组和MND_TDP队列的组装体平均强度无显著差异，但利用SiMPull的单分子特性能够检测强度分布的显著差异。这一分析显示MND_TDP小脑中存在更多、更亮的TDP-43组装体，而这一趋势在额叶皮层中相反。这些数据共同支持疾病来源多聚TDP-43组装体中存在细微但显著的差异。

疾病中多聚TDP-43组装体的形态特征

能够解析衍射极限以下组装体的超分辨方法（如dSTORM）为在纳米尺度确定粒子形态提供了途径。通过dSTORM，对使用SiMPull捕获的单个TDP-43阳性组装体的形态进行了详细盘点。

研究发现不同队列间三个形态特征的平均值存在显著差异：长度、偏心度和定位密度。长度和偏心度关乎组装体的整体形状，而定位密度是单个组装体内可及靶表位分布的度量。MND_TDP来源的TDP-43阳性组装体倾向于更长、更伸长，这些差异在小脑来源提取物中达到统计学显著性。此外，疾病来源提取物中每个组装体的flTDP定位密度显著降低，支持MND与TDP-43组装体的改变组成和/或结构相关的断言。

除了平均特征差异外，发现由形态特征定义的特定组装体亚群在MND_TDP来源提取物中的流行程度不同。利用SiMPull的单粒子特性，可以根据长度（"长"≥100纳米）、偏心度（"纤维状"≥0.9）和定位密度（"密集"≥0.01定位点/纳米2）分离单个组装体。Sankey图同时可视化落入每个类别的所有组装体比例，以及不同类别成员身份特征的不同亚群在疾病和神经学正常大脑间的变化。

研究发现与疾病相关的长、纤维状、稀疏标记组装体比例在小脑和额叶皮层样品中均增加，印证了从平均值比较得出的结论。此外，这种可视化揭示了一个细长、球状、稀疏标记的组装体亚群在疾病来源提取物中增加。这些发现凸显了单粒子测量在检测表征MND的特定TDP-43组装体亚群中的效用，而这些亚群对传统方法或总结性度量是不可见的。

MND来源TDP-43组装体含有疾病和组织特异性独特形态特征

目前报告的TDP-43阳性组装体的六个参数支持疾病相关差异。有趣的是，这些差异在小脑样品中最为明显和稳健，其中粒子数量以及被分类为长、纤维状和密集的组装体比例在不同队列间存在区别。

考虑到在队列间观察到的亚群细微差异，研究推断所有测量参数的组合最能有效区分这些队列。为此，选择了监督降维工具线性判别分析（LDA），该工具能确定最佳表征或分离多个类别的参数线性组合。

当投影到二维平面时，LDA明显分离了每个队列，并轻松区分了来自不同组织的提取物。第一和第二维度分别包含了类别间80.2%和11.5%的方差。不出所料，对所得伪特征向量的分析将密度、偏心度和长度列为对这种分离贡献最强的参数。当将可扩散提取物的测量值与嵌入提取物结合时，这种分离同样明显，在仅考虑嵌入提取物测量值时更为显著，其中前两个维度分别包含了97.7%和1.5%的方差。

纳米级TDP-43组装体的组成具有疾病特异性

TDP-43的病理翻译后修饰（如409/410位丝氨酸磷酸化）被认为是病理微观聚集体的关键标识符；这些修饰在纳米级TDP-43组装体中也可检测。使用第二个荧光标记检测抗体，SiMPull能够进行低通量组成分析，从而确定与第二个感兴趣靶点共标记的目标组装体比例。

如预期，使用针对磷酸化丝氨酸409/410（pSER）修饰TDP-43的特异性抗体，观察到MND_TDP来源额叶皮层嵌入提取物中共标记TDP-43组装体数量存在小幅但显著的增加。

为拓宽对TDP-43组装体组成的表征，首先通过蛋白质组学无偏好性地鉴定使用CAP1亲和纯化捕获的聚集体组分中的蛋白质。在缺乏构象特异性TDP-43抗体的情况下，CAP1使我们能够特异性鉴定与TDP-43聚集体结合的聚集相关蛋白，然后通过SiMPull直接评估其与TDP-43聚集体的结合情况。

从每个额叶皮层嵌入提取物中四重复分离聚集体，通过串联质量标签（TMT）进行同标标记，并与等效总蛋白质组样品一起通过质谱进行量化。为消除总蛋白质组组成差异带来的任何偏差，首先根据相同蛋白质的总蛋白质组比率校正聚集体组分中鉴定蛋白质的丰度比。总体而言，在总和聚集体组分中鉴定到1917种蛋白质，其中1238种被充分量化以计算校正比率。

最终校正比率通过标准阈值进行分割，得出在MND_TDP来源提取物聚集体组分中过度表征或低度表征的最终蛋白质列表。共有21种蛋白质在聚集体组分中显著富集，而38种显著减少。TDP-43被量化，但与单分子测量一致，在MND_TDP队列中未显著富集。相比之下，Tau（P10636）在MND_TDP聚集体组分中富集，尽管不显著。Tau聚集主要与tau蛋白病如阿尔茨海默病和皮克病相关，但最近在一部分MND病例的额叶皮层中被鉴定。

使用PantherGOslim进行基因本体富集分析，在显著富集蛋白质中未鉴定到富集本体术语，这与在全蛋白质组中观察到的差异不同。然而，在MND_TDP来源提取物聚集体组分中过度表征的蛋白质集合通过已知蛋白质-蛋白质相互作用的连接程度显著高于类似大小网络的随机预期。这与功能连接的蛋白质网络在聚集体内共沉淀一致。

选择靶蛋白通过SiMPull评估其与TDP-43聚集体的特异性关联，包括在疾病来源聚集体组分中丰度较低的NPM1和丰度较高的USO1。此外，选择了一组通常与外泌体相关的蛋白质：CD9、CANX和HSP70（疾病相关差异被认为不显著），以及TSG101和CD63（未在蛋白质组分析中鉴定）。细胞外囊泡分泌已被确定为从细胞质清除TDP-43的关键途径，当抑制时导致细胞质TDP-43焦点积累。HSP70在细胞模型中显示强力招募到此类细胞质TDP-43焦点。最后，选择了FUS，一个同样与MND相关的蛋白质，并发现在过表达TDP-43的细胞模型中形成不溶性聚集体。

研究发现，与神经学正常对照组相比，MND_TDP队列中显著更多的TDP-43组装体含有NPM1、HSP70、FUS、CD9和CANX。尽管目标阳性斑点总数无差异，且通过蛋白质组学测量的HSP70、FUS、CD9和CANX在聚集体组分中的总丰度相应缺乏显著差异。

利用单个粒子的超分辨形态测量，能够将用这些靶蛋白修饰的TDP-43聚集体的特征与那些没有的区分开来。在TDP-43组装体的长度方面未发现共标记偏差。然而，观察到与含有HSP70、FUS、CD9和CANX的TDP-43组装体相关的偏心度和定位密度分布存在显著差异。共标记组装体缺乏存在于单标记组装体中的更偏心、稀疏标记亚群。这个缺失的群体让人联想到与MND_TDP队列中富集的TDP-43组装体相关的特征。这些发现共同表明疾病中TDP-43组装体的复杂调控：稀疏标记的纤维状TDP-43组装体积累，然而一群球状、密集标记的TDP-43组装体更频繁地参与细胞输出机制。这些观察强调了单分子方法在表征和解开MND复杂特征中的效用。

讨论

单分子显微技术为研究疾病相关蛋白聚集体提供了无与伦比的分辨率和灵敏度。本研究应用两种新型单分子下拉配置结合亲和蛋白质组学来量化和表征含有TDP-43的蛋白组装体。研究发现MND_TDP额叶皮层提取物中TDP-43阳性组装体较少，但这些组装体倾向于更长、更纤维状，并被针对RRMs基序的抗体稀疏标记。这与成熟TDP-43聚集体的暴露完全一致，其中纤维状聚集体的C端淀粉样核心通过RRM结构域的切割而暴露。重要的是，这些特征足以区分疾病和对照队列的提取物。鉴于这些差异在可扩散和嵌入提取物中均被观察到，它们很可能在更易接近的生物流体（如脑脊液或血清）中明显。这些生物流体的增强可及性将支持分析更大队列和更多实验范式，例如纵向监测，使该技术成为强大的潜在诊断和疾病分期工具。

MND_TDP来源TDP-43阳性组装体在额叶皮层中相对丰度较低但在小脑中较高是违反直觉的。然而，末期聚集体的暴露可能在额叶皮层最为突出，因为该区域在疾病早期受累，使得聚集体得以成熟。结合额叶皮层中pSER阳性组装体的较高相对丰度，这些结果与额叶皮层表现出晚期TDP-43聚集体病理一致，该病理在整个疾病过程中进展。相比之下，TDP-43病理在大脑中的传播在小脑到达疾病晚期，意味着我们预期未成熟TDP-43聚集体在疾病末期占主导。确实，小脑TDP-43病理通过经典免疫组织化学方法可变地被检测到，并且直到最近通过敏感分子技术才被可靠检测。与此一致，研究发现MND_TDP中小脑来源TDP-43阳性组装体更多，且pSER阳性无显著差异。因此，这些组装体可能反映了尚未暴露的早期阶段聚集体。

对聚集体组成的探索揭示了疾病和对照提取物之间的额外细微差异。疾病来源聚集体的组成通过鉴定在聚集体中发现的蛋白质的潜在毒性功能获得或丧失，为了解疾病机制提供见解。最近，来自各种疾病模型和组织的不可溶聚集体组分的蛋白质组量化已经提供了几个此类数据集。然而，我们独特的蛋白质组和显微镜方法组合凸显了考虑聚集体组成异质性的必要性，这一特性是批量蛋白质组方法无法获得的。在我们检查的示例中（包括具有一系列聚集体组分相对富集度的蛋白质），我们发现蛋白质在聚集体组分中的相对丰度与这些蛋白质与单个TDP-43阳性聚集体关联的可能性之间几乎没有相关性。相反，我们观察到聚集体亚群的形态根据这些蛋白质是否存在于聚集体中而不同。重要的是，对额外蛋白质呈阴性的TDP-43阳性聚