伤害性神经源CGRP通过促进CD140b+CD146+成纤维细胞分化加剧子宫腺肌病纤维化

本研究揭示伤害性神经通过分泌CGRP（降钙素基因相关肽）与RAMP1hiCD140b+CD146+成纤维细胞互作，经ERK通路驱动CHI3L1+成纤维细胞分化，促进子宫腺肌病（AM）纤维化进程。采用FDA批准的RAMP1拮抗剂Rimegepant干预，有效缓解纤维化并恢复生育能力，为AM提供了非激素治疗新策略。

　　

1 引言

子宫腺肌病（Adenomyosis, AM）是一种常见的良性妇科疾病，影响7-23%的育龄女性，其特征为子宫内膜腺体和间质异常侵入子宫肌层。进行性痛经和肌层广泛纤维化是AM的典型表现，约80%的患者出现继发性痛经。伤害性神经介导痛经过程，但其在AM相关纤维化中的作用尚不明确。降钙素基因相关肽（CGRP）主要由背根神经节（DRG）中最细的无髓鞘伤害性神经元释放，通过与受体活性修饰蛋白1（RAMP1）结合的降钙素受体样受体传递信号，参与伤口愈合、炎症反应、细胞外基质稳态和能量代谢等多种生理和病理过程。

尽管AM的确切机制不清，但存在子宫内膜侵袭、胚胎多能性苗勒管残余化生或干细胞分化的推测。子宫内膜中存在相当比例的干细胞/祖细胞，包括阶段特异性胚胎抗原（SSEA1）⁺上皮细胞、CD140b⁺CD146⁺细胞和含有 sushi 结构域2（SUDS2）⁺间充质干细胞。在骨关节炎、皮肤再生和肺纤维化等疾病中，神经系统通过调节干细胞行为影响组织形态发生、再生和疾病进展。临床回顾性研究显示，AM患者痛经严重程度与病变硬度呈显著正相关，提示AM病变中存在神经-成纤维细胞相互作用的微环境。

2 结果

2.1 AM患者样本和小鼠模型中观察到CGRP⁺伤害性神经的过度表达伴随局灶性纤维化

研究首先探讨了AM患者子宫肌层中神经纤维密度与纤维化的关系。与阴性对照组（NC）相比，AM组子宫肌层出现腺体和间质的病理侵袭。免疫荧光（IF）分析显示，AM组基底层和连接区的神经纤维增加。异位病灶周围通过Masson三色染色观察到过度的胶原沉积，用标记蛋白基因产物9.5（PGP9.5，也称为泛素C末端水解酶L1）染色的丰富神经纤维表现出共定位。随后通过共染色神经纤维标志物微管蛋白β3 III类（TUBB3）和伤害性神经标志物CGRP检查感觉神经密度，结果表明CGRP⁺伤害性神经在AM病变中富集。

接下来评估了纤维化相关蛋白纤连蛋白（FN）和I型胶原α1链（COL1A1）、肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白（αSMA）以及神经相关蛋白包括神经生长因子（NGF）、PGP9.5、CGRP及其受体RAMP1的表达模式。蛋白质印迹（WB）分析显示，与NC样本相比，AM病变中这些蛋白的表达增加。与WB结果一致，定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示AM病变中编码FN、COL1A1、αSMA（基因名：ACTA2）、NGF、PGP9.5和RAMP1的基因表达升高。这些结果表明疾病进展中的纤维化状态伴随神经发生信号和伤害性神经纤维密度增加。酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组织化学（IHC）研究证实，与正常肌层相比，AM病变中CGRP表达升高。

上述表型在他莫昔芬诱导的子宫腺肌病小鼠模型（M）中也观察到。动物实验的研究设计显示，在6周时从小鼠（对照组，n=10；M组，n=10）收取子宫。IF染色证明M组子宫肌层中E-钙黏蛋白（上皮细胞标志物）表达紊乱，而对照组显示正常的肌层和子宫内膜生长模式。这些结果确认了AM模型的成功建立。子宫组织中观察到胶原沉积显著增加，表明AM诱导了纤维化重塑的增强。肌层炎症和子宫内膜-肌层接口的破坏也导致了在位子宫内膜的病理变化。既往研究和本研究结果表明，异位病灶和在位子宫内膜均表现出免疫失调，包括淋巴细胞和巨噬细胞群体增加以及促炎细胞因子升高，导致在位子宫内膜功能障碍（如纤维化、子宫内膜变薄和血液供应减少）。为表征AM模型小鼠的这些变化，测量了子宫内膜厚度和血管密度。与对照组相比，M组显示子宫内膜厚度和血液供应显著减少。FN和αSMA的蛋白和基因表达水平在M组也升高。与既往研究一致，患有AM的小鼠表现出热痛觉过敏，反映为热板潜伏期缩短。

与人样本不同，在小鼠子宫中未通过WB检测到CGRP蛋白。这种缺失可能归因于组织释放后CGRP的半衰期短以及人与小鼠之间异位病灶体积的巨大差异。然而，与对照组相比，在M组的DRG中检测到更多CGRP⁺神经元。与对照组相比，AM小鼠的子宫也表现出CGRP⁺伤害性神经纤维水平升高，伴随NGF和PGP9.5的蛋白和mRNA表达水平更高。一个未预期的发现是，与人类样本相比，AM小鼠的RAMP1蛋白表达不太明显。这种差异的一个可能解释是样本收集方法的差异：在人类中分析了肌层中的异位病灶，而在小鼠中分析了全层子宫样本。鉴于RAMP1也分布在子宫内膜间质中，小鼠全层子宫组织的包含可能部分掩盖了差异。

2.2 伤害性神经消融减轻诱导AM小鼠的子宫纤维化

为进一步研究纤维化与伤害性神经之间的关系，检查了伤害性神经去神经支配在AM中的效果。使用树脂毒素（RTX）建立了感觉神经去神经支配小鼠模型，如既往研究所述。总共24只小鼠被纳入本实验，随机分配到四组：对照组、接受RTX的对照小鼠（RTX-C）、诱导AM的小鼠（M）和诱导AM并接受RTX的小鼠（RTX-M）（每组n=6）。在第63天收取子宫。IF分析确认对照组和RTX-C组均不存在AM。

通过IHC和WB分析表明，RTX成功消融了小神经纤维，表现为子宫中PGP9.5和NGF表达减少。IF分析确认了DRG中CGRP⁺神经元的耗竭。使用热板测试的功能评估显示RTX-C和RTX-M组后爪撤回潜伏期延长，表明小神经纤维消融导致热感觉受损。

M组的热感觉阈值低于对照组。RTX-M组子宫的组织学切片显示，与M组相比，肌层更规则、异位病灶浸润减少、子宫内膜厚度增加和纤维化区域减少。有趣的是，与对照组相比，RTX-C和RTX-M组的血管密度显著降低。

与M组相比，RTX-M组FN、COL1A1、αSMA以及NGF和PGP9.5的表达水平降低，提示伤害性神经在促进AM纤维化中起作用。四组间RAMP1表达无显著差异。

总之，这些结果表明，消融CGRP⁺伤害性神经改善了AM小鼠的病变发展，并表明伤害性神经参与AM的纤维化进展。

2.3 单细胞转录组分析揭示CGRP对成纤维细胞发挥作用

研究结果表明CGRP⁺伤害性神经有助于AM中的纤维化进展。为进一步研究CGRP与异位病灶微环境之间潜在的通讯，对来自进行性痛经（视觉模拟评分≥4）患者的异位AM组织（n=3）和接受子宫切除术患者的健康肌层组织（NC，n=3）进行了scRNA-seq。分析了这六名患者的53721个细胞的转录组数据。表达超过200个基因且线粒体独特分子标识符（UMI）率低于20%的细胞通过质量过滤；线粒体基因从表达表中排除。总共获得48485个高质量细胞谱用于下游分析；排除5236个细胞。检测到的基因中位数为2698。通过使用均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维和基于图的聚类构建了单细胞图谱，将细胞划分为26个簇。基于已知的谱系特异性细胞标志物，簇被分为11种主要细胞类型：成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴管内皮细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞、NKT细胞、肥大细胞和中性粒细胞。每个簇中排名前三的差异表达基因在点图中显示。

为识别CGRP靶向的细胞类型，筛选了簇并观察到成纤维细胞群体是主要的RAMP1表达亚群。与NC组相比，AM组中RAMP1表达更高。11种不同细胞类型在NC和AM组之间存在差异。每种细胞类型的观察到预期细胞比率分析显示，AM组织中含有更大比例的成纤维细胞和更小比例的平滑肌细胞，表明异位病灶微环境内细胞分化改变。成纤维细胞簇是AM和NC组之间最显著不同的细胞群体之一。

原代细胞的多重IF染色验证了AM组成纤维细胞表达更高水平的RAMP1。根据标志基因将成纤维细胞分为八个亚组，使用癌症相关成纤维细胞的分类框架。AM病变中含有更大比例的胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）高表达、分泌型卷曲相关蛋白4（SFRP4）高表达和几丁质酶3样1（CHI3L1）高表达成纤维细胞，与qPCR验证一致。

2.4 单细胞转录组分析揭示RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺血管成纤维细胞亚簇作为CGRP的效应细胞并在AM病变中分化为CHI3L1成纤维细胞亚集

在八个成纤维细胞亚组中，血管成纤维细胞表现出最高的RAMP1表达密度。血管成纤维细胞的基因本体（GO）分析显示在细胞迁移、轴突引导、血管生成和成肌细胞分化中富集。血管成纤维细胞也表达高水平的黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM；CD146的基因名称），它是子宫内膜间充质干细胞（eMSCs）的标志物。另一个eMSC标志物血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ；CD140b的基因名称）也在血管成纤维细胞中检测到（在图4B中用黑色虚线标出）。然而，PDGFRβ表达并非血管成纤维细胞簇独有。为比较两组间PDGFRβ表达差异，对单细胞转录组数据进行了额外分析。值得注意的是，AM组血管成纤维细胞中的PDGFRβ表达显著高于NC组。

此外，对AM和NC样本中成纤维细胞簇内的MCAM、PDGFRβ和RAMP1进行了相关性分析。仅在AM患者中观察到MCAM与PDGFRβ以及MCAM与RAMP1之间的正相关；在NC组未检测到统计学显著相关性。这些结果表明，表达RAMP1、MCAM和PDGFRβ的血管成纤维细胞可能在CGRP介导的AM纤维化中起关键作用。结合子宫内膜内陷和干细胞分化在AM发病机制中的主流理论，得出结论认为AM中这些特定的血管成纤维细胞很可能起源于子宫内膜。

对40例患者样本（NC，n=20；AM，n=20）中PDGFRβ和MCAM的qPCR分析证实，与NC组相比，AM病变中PDGFRβ和MCAM mRNA表达水平增加。AM病变也表现出更多共表达波形蛋白（成纤维细胞标志物）的CD140b⁺CD146⁺成纤维细胞。为确定此独特细胞群在AM病变中的位置，进行了与CD31（血管标志物）的多重IF染色，发现CD140b⁺CD146⁺成纤维细胞毗邻血管。这一发现与子宫内膜中CD140b⁺CD146⁺ eMSCs的血管周定位一致。

因此，研究聚焦于AM病变中的RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺血管成纤维细胞。为进一步研究成纤维细胞在AM病灶微环境内潜在的过渡过程，使用Monocle2构建了成纤维细胞发育轨迹的伪时间图谱。血管成纤维细胞簇被识别为轨迹的起源。NC和AM组之间的分化轨迹不同。CHI3L1成纤维细胞簇位于血管成纤维细胞的下游（图4F,G中的黑色圆圈），而在NC组未观察到从血管成纤维细胞的连续分化。

CHI3L1在多种疾病中已证明参与纤维化和侵袭，并可能作为纤维化生物标志物。GO分析表明，CHI3L1成纤维细胞簇在细胞外基质组织、上皮-间质转化的正向调控、组织重塑的调控和伤口反应调控中富集。这些生物过程与AM病灶微环境中观察到的反复组织损伤和修复以及纤维化一致。通过WB评估了来自NC和AM患者的十份肌层样本（NC，n=5；AM，n=5）以确定CHI3L1表达。结果显示AM组中CHI3L1表达更高。尽管AM患者中CHI3L1表达表现出异质性，可能由于个体差异，但它仍在AM病变中独特表达，而在对照组织中缺失。鉴于肌层细胞外基质沉积是AM的标志，得出结论认为CHI3L1成纤维细胞代表AM病变中独特的成纤维细胞亚集，参与纤维化微环境的形成。

总之，识别了一群独特的RAMP1^hiCD146⁺CD140b⁺成纤维细胞作为CGRP的效应细胞。这些细胞被激活并分化为CHI3L1成纤维细胞亚集，最终促进AM病变中的纤维化。

2.5 CGRP通过细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路激活RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞并促进细胞外基质分泌

为进一步研究CGRP⁺伤害性神经是否驱动RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞加速纤维化进展，从三名AM患者提取并培养了原代腺肌病异位病灶来源的成纤维细胞（AMDFs）。使用磁珠选择从AMDFs中分离出CD140b⁺CD146⁺成纤维细胞，如先前所述。通过流式细胞术验证磁选效率；通过多重IF染色证明了CD140b、CD146和RAMP1标志物的共表达模式。

建立了一个共培养系统，其中验证了大鼠的DRG，并与RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞共培养24小时，使用或不使用RAMP1拮抗剂rimegepant。在此DRG共培养系统中，RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞中FN、COL1A1和CHI3L1的蛋白和mRNA水平增加。除了特征性的CHI3L1表达外，CHI3L1成纤维细胞还表现出高基因表达水平的SRY盒转录因子4（SOX4）、Wnt家族成员2（WNT2）、基质金属蛋白酶10（MMP10）、MMP11和MMP14。既往研究表明，SOX和MMP家族与组织重塑、细胞外基质稳态、细胞侵袭和血管生成相关，这些过程与AM病灶微环境中观察到的过程一致。qPCR分析确认DRG共培养后这些基因上调。然而，添加rimegepant逆转了这些效应。

为进一步评估分子机制，直接用CGRP（100 nM，24小时）处理RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞；在CGRP刺激前30分钟添加rimegepant（100 nM）或载体。CGRP处理以时间依赖性方式诱导ERK磷酸化。还观察到CGRP处理增强了纤维化相关蛋白和基因表达，以及涉及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）和ERK的磷酸化。这些效应被随后给予rimegepant所抑制。作为RAMP1受体的拮抗剂，rimegepant还降低了与CHI3L1成纤维细胞相关的基因表达，包括SOX4、WNT2、MMP10、MMP11和MMP14。

总之，这些结果表明，源自伤害性神经的CGRP通过激活ERK通路促进RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞向CHI3L1成纤维细胞的表型转换，从而加速AM中的病灶纤维化。

2.6 CGRP/RAMP1信号阻断诱导小鼠纤维化缓解和生育能力恢复

基于关于CGRP⁺伤害性神经对RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞效果的初步证据，在AM模型小鼠中进行了拯救实验。总共83只雌性小鼠被分配到三组：对照组、诱导AM的小鼠（M）和用rimegepant处理的AM模型小鼠（Rime）。小鼠在接受rimegepant21天后被处死或纳入生育实验。在对照组中未观察到AM迹象。

在第63天收集组织样本。H&E染色显示，与M组（n=8）相比，Rime组（n=8）异位病灶浸润得到改善。进行了Masson三色染色，并对胶原阳性区域进行了半定量分析。与M组（n=8）相比，Rime组的纤维化百分比显著降低（p < 0.0001）；与对照组（n=8）相比无显著差异。Rime组的子宫内膜厚度和血管密度增加。此外，Rime组的热痛觉阈值恢复，表明疼痛缓解。与M组相比，Rimegepant显著抑制了FN、COL1A1、αSMA、NGF和PGP9.5在蛋白和基因水平的表达。三组间RAMP1表达无显著差异。

交配后第21天，处死小鼠并收取子宫。值得注意的是，与M组（n=27）相比，Rime组（n=22）表现出更高的妊娠率（50%对29.6%，p=0.0395，卡方检验）和更少的流产胚胎（15.8%对36.2%，p=0.0048，卡方检验）。对妊娠晚期小鼠的观察显示，Rime组发育正常，而M组经历流产。这些发现表明，rimegepant通过阻断CGRP-RAMP1轴维持细胞外基质稳态，有助于AM模型小鼠的生育能力恢复。

3 讨论与结论

AM以广泛纤维化和进行性痛经为特征。AM的发展和进展涉及多种潜在的病理生理机制，包括增殖、迁移、侵袭、纤维化、血管生成、炎症、氧化应激、免疫反应和表观遗传改变。异位子宫内膜 stromal 细胞分泌大量NGF，增加了病灶内感觉神经纤维密度，从而诱导过度神经再生和感觉神经肽表达升高。几种分子机制已被牵涉于AM发展，包括ERK、WNT/β-catenin和磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路。

在本研究中，在患者和小鼠模型的AM样本子宫肌层中观察到伤害性神经密度增加；CGRP、PGP9.5和NGF表达水平升高；以及纤维化增强。还发现小鼠模型中的伤害性神经消融改善了病灶浸润和纤维化。scRNA-seq证明AM病变中含有表型异常的成纤维细胞。在此群体内，血管成纤维细胞簇显示最高的RAMP1表达。伪时间分析识别了此簇中一群在AM病变中共表达CD140b和CD146的独特细胞。它们通过IF显示的血管周定位与CD140b⁺CD146⁺ eMSCs一致。此外，体外实验证明CGRP通过ERK信号通路诱导RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞向肌成纤维细胞转变。在AM小鼠模型中，rimegepant介导的CGRP受体RAMP1阻断减轻了纤维化、降低了疼痛敏感性并增加了植入胚胎数量。总之，这些结果表明伤害性神经源CGRP通过CGRP/RAMP1/ERK轴作用于RAMP1^hiCD146⁺CD140b⁺成纤维细胞促进AM中的纤维化。

越来越多的证据表明，伤害性神经及其分泌的神经肽在慢性炎症、纤维化和干细胞分化中起关键作用。在子宫内膜异位症——一种与AM病理生理学类似的疾病中，伤害性神经直接浸润病灶并通过神经肽信号加速纤维发生。本研究结果与已发表的共识一致，确认了伤害性神经源CGRP参与AM内的纤维化，并强调神经-成纤维细胞互作是AM相关纤维化的关键放大器。

作为一种慢性炎症疾病，AM与炎症信号失调相关。测序结果显示AM病变中含有数量增加的细胞毒性CD8⁺ T细胞和丰富的耗竭CD8⁺ T细胞，与最近发现一致。尽管AM病变中细胞毒性CD8⁺ T细胞数量增加，但这不足以阻止异位子宫内膜细胞在肌层中的异常聚集和持续存在。认为这种聚集和持续与以耗竭CD8⁺ T细胞为主导的免疫抑制微环境形成有关。CGRP作为伤害性神经中的神经肽，也直接调节免疫细胞分化，包括调节表达RAMP1的CD8⁺ T细胞耗竭，使分化偏向Th1细胞，并将巨噬细胞极化为促修复表型。因此，CGRP⁺伤害性神经与AM病变中免疫细胞之间的互作及其对疾病进展的影响是未来研究的重要焦点。

ERK介导转录因子的磷酸化并调节下游靶基因的表达。研究表明，ERK/CREB或ERK/激活蛋白-1（AP-1）信号驱动癌症和纤维化疾病中的细胞分化和成纤维细胞向肌成纤维细胞转变。ERK介导的转录因子如AP-1和CREB的磷酸化可能允许它们与CHI3L1启动子结合，从而调节CHI3L1转录和表达。此外，测序结果和其他研究表明，CHI3L1激活ERK和β-catenin信号通路，有助于细胞存活、增殖、上皮-间质转化和血管生成。CHI3L1是协调炎症、损伤和修复反应的关键分子节点；它由多种细胞类型分泌，包括巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞。本研究结果证实了既往关于CHI3L1在子宫内膜异位症和AM中的研究。观察到AM病变中CHI3L1成纤维细胞比例增加和CHI3L1表达升高，这有助于细胞外基质沉积和组织重塑。这些结果表明CHI3L1是AM纤维化的重要贡献者。

值得注意的是，scRNA-seq分析揭示了AM病变内不同的成纤维细胞亚簇。除了CHI3L1成纤维细胞和血管成纤维细胞外，与NC组相比，AM组表现出SFRP4成纤维细胞和IGFBP2成纤维细胞的特异性富集。这一发现与现有证据一致，表明IGFBP和SFRP家族参与AM发病机制。这些新识别的SFRP4⁺和IGFBP2⁺亚群的具体功能作用，以及它们与CHI3L1成纤维细胞和血管成纤维细胞的潜在相互作用，是未来研究的有趣途径，以阐明它们对AM进展的集体贡献。

还观察到与NC组相比，AM组基底层和连接区的神经纤维密度增加，与既往发现一致。超神经支配的在位子宫内膜在AM或子宫内膜异位症发展过程中在基质侵袭和转移中的作用值得进一步研究。

本研究存在一些局限性。首先，由于疼痛感知和疾病进展的个体差异，未评估痛经或纤维化程度。其次，伤害性神经也在局部分泌P物质，已证明在子宫内膜异位症中加速病灶发展。P物质对AM纤维化的效果需要进一步研究。最后，识别了AM病变中一群独特的成纤维细胞群体，其表达与eMSCs相同的标志物（CD140b⁺和CD146⁺）。未来研究应探索这些细胞是否具有干细胞特性。

总之，从伤害性神经和疾病进展的角度考察了AM发病机制。使用scRNA-seq证明伤害性神经及其神经肽CGRP通过ERK通路促进RAMP1^hiCD140b⁺CD146⁺成纤维细胞分化。Rimegepant是一种CGRP/RAMP1抑制剂，可预防病灶发展和纤维化，减轻疼痛敏感性，并保护AM小鼠的生殖健康和生育能力。据所知，这是AM中首个聚焦伤害性神经和CD140b⁺CD146⁺成纤维细胞的研究。研究结果为AM的纤维化病理机制提供了新视角，并突出了靶向CGRP⁺伤害性神经的非激素治疗潜力。