系统性分析T细胞迁移动力学：揭示小鼠黑色素瘤中CD8+ T细胞的双状态迁移模式及其免疫治疗意义

本综述提出了一种基于聚类技术和隐马尔可夫模型（HMM）的系统性算法，用于分析CD8+ T细胞在黑色素瘤肿瘤中的迁移行为。研究发现T细胞遵循快速（持久）和慢速（局部搜索）双状态迁移模式，并存在动态切换（约4分钟/次）。该模型为优化T细胞免疫疗法提供了关键理论依据，可广泛应用于不同细胞类型的迁移研究。

　　

Abstract

T细胞需要在监测大面积区域和高效接触靶细胞之间进行权衡选择，这一过程体现为其运动速度和转向角的变化。本研究提出了一种通用算法，通过聚类技术识别不同迁移状态的数量，并利用隐马尔可夫模型（HMM）捕捉状态间的动态转换。该算法仅需时间序列上的位置观测数据，适用于研究各种细胞类型的迁移行为。通过对黑色素瘤肿瘤中低亲和力和高亲和力T细胞的体外双光子显微镜追踪，发现CD8⁺ T细胞遵循双状态迁移动力学：一个状态快速运动，另一个状态慢速且更局部化。此外，本研究建立了统计方法来区分细胞速度的真实变异性与单一速度下的随机波动，该方法可跨实验平台应用。

1 Introduction

细胞迁移在不同生物体和尺度中都具有关键功能。免疫应答的有效性取决于巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和CD8⁺ T细胞等免疫细胞如何高效迁移并定位清除病原体。CD8⁺ T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分，在机体对病原体和肿瘤细胞的免疫监视中发挥核心作用。其高特异性使得基于CD8⁺ T细胞的癌症免疫疗法迅速兴起，如嵌合抗原T细胞疗法和肿瘤浸润淋巴细胞疗法。与血液恶性肿瘤相比，T细胞免疫疗法对实体瘤的疗效较差，这提示CD8⁺ T细胞迁移能力是限制其浸润和导航复杂微环境的关键因素。

许多统计模型已被提出用于描述细胞迁移运动。最简单的布朗运动模型以1827年罗伯特·布朗观察花粉在水中运动而命名。1905年爱因斯坦从概率密度角度推导出扩散方程并提出三个基本假设：时间间隔独立无关、位移同分布、位移二阶矩存在。布朗运动的均方位移（MSD）与时间间隔呈线性关系，但实际细胞迁移经常违反其第一假设，因此出现了如持久随机游走（PRW）等模型。PRW模型通过速度^S和持久时间^P参数化细胞运动，类比于Ornstein-Uhlenbeck随机过程。

CD8⁺ T细胞的迁移不能用传统布朗运动或PRW模型充分描述。Boisfleury-Chevance等发现淋巴细胞表现出与粒细胞和单核细胞完全不同的迁移行为，推测其遵循双状态迁移模式。Sadjadi等也指出T细胞在3D胶原基质中存在三种运动类型：慢速、快速和混合型。众多模型中，Lévy行走曾被用于解释脑感染中T细胞行为，但因无限方差和似然函数使用不当而受到批评。Banigan等采用高斯混合模型（GMM）描述淋巴结中T细胞的非布朗运动，但未能捕捉状态间动态转换。Jerison等提出速度-持久性耦合模型，但其普适性尚未明确。

隐马尔可夫模型（HMM）最初用于语音识别，后广泛应用于生物序列分析。在细胞迁移中，HMM被用于推断不同形态状态间的动态转换和细胞运动的随机行为。Degerman等将双状态HMM应用于神经胶质祖细胞和2型星形胶质细胞，发现后者2/3时间遵循定向运动模式。Torkashvand等通过运动模式（Lévy和布朗类型）和步长增量（短和长）对CD8⁺ T细胞进行聚类，揭示了细胞间的异质性。

2 Results

2.1 T Cell Migration Heterogeneity

使用Imaris软件对B16黑色素瘤肿瘤中浸润的CD8⁺ T细胞进行追踪，拍摄时间30分钟，帧间隔32秒。红色细胞代表低亲和力T细胞，绿色代表高亲和力T细胞。与其他免疫细胞（如单核细胞和粒细胞）相比，两种T细胞群体均表现出独特的迁移模式，似乎不是由单一迁移速度描述，而是呈现由明显慢速和快速运动状态组成的双模式运动。慢速状态更局部化，可能与T细胞与靶细胞（如树突状细胞和肿瘤细胞）的接触有关；快速状态则具有方向持久性。

通过Kolmogorov-Smirnov（KS）检验比较低和高亲和力CD8⁺ T细胞在^x、^y、^z轴上的位移分布，发现两个群体存在差异（p值分别为0.024、0.0001和0.016），这可能源于不同的解离速率。

为评估T细胞个体间的迁移模式变异性，计算了每个细胞的时间平均均方位移（TAMSD）和平均位移自相关函数（ACF）。TAMSD显示细胞间差异显著：低值表明T细胞因与靶细胞相互作用而进行局部搜索，增加值则对应持久随机游走。群体水平上，平均ACF拟合单指数函数^e-t/τ，低亲和力T细胞衰减时间常数τ=1.85分钟，高亲和力τ=1.63分钟，表明两者迁移差异较小。低亲和力T细胞稍高的衰减时间常数可能源于其更长时间的持久迁移而未有效接触靶细胞。

2.2 The Normality Tests Reject the Possibility of a Single Gaussian

布朗运动中位移分布服从高斯分布。通过QQ图和Anderson-Darling检验对总位移分布进行正态性检验，发现数据（红点）在各方向均显著偏离高斯分布（黑线），分布尾部较重，表明位移分布比高斯分布更具重尾特性。Anderson-Darling检验同样拒绝正态性原假设，说明T细胞迁移不能由单一随机运动系数描述。

2.3 The Gaussian Mixture Model Indicates a Two-State Migration

正态性检验拒绝单一迁移模式后，问题在于多状态模型是否能更好描述T细胞迁移。重尾位移分布提示可能用Lévy行走描述，但该模型因无限方差和似然函数误用受批评。本研究采用GMM揭示两个T细胞群体中的迁移状态数量，假设分布均值为零且协方差各向同性。Akaike信息准则（AIC）和贝叶斯信息准则（BIC）均显示最优聚类数为二（基于肘部法则），更多状态数并未进一步降低AIC和BIC，表明快速和慢速双状态是最小需求。这与Banigan等发现一致。

从参数表可见，低和高亲和力T细胞在各状态占比相似，但低亲和力T细胞各状态方差较大，因其速度稍快。GMM有助于检验数据是否可由单一迁移模型解释或存在子状态，但仅作为聚类方法使用，不能捕捉状态间动态转换。

2.4 The Hidden Markov Model Captures the Dynamic Behavior of T Cells

GMM提示T细胞存在双状态迁移行为（快速和慢速），但无法捕捉其动态行为。因此应用隐马尔可夫模型（HMM）识别状态间转换概率。观测变量为xy平面步长、转向角和z轴位移，其概率分布由特定方程描述。结果显示快速状态步长分布更宽（即更快），角度分布集中在零附近（即更持久，较少转向），证实了持久运动与快速迁移相关的推测；慢速迁移则伴随近乎均匀的转向角分布，符合小范围随机探索特征。低亲和力T细胞在快速和慢速状态均比高亲和力T细胞移动稍快。

转移概率表显示两种T细胞群体的状态转换概率相似。每行代表当前状态，每列代表可能下一状态，行元素和为1（必须保持当前状态或切换至另一状态）。T细胞改变状态的平均概率为0.136，相当于转换率约0.25 min^-1（约每4分钟切换一次）。因此，T细胞每分钟改变状态的概率约25%，且与亲和力无关。

通过伪残差（又称分位数残差）评估拟合模型。QQ图显示其与正态分布高度一致，各观测变量的ACF较弱，表明HMM对数据拟合良好。高亲和力T细胞步长伪残差的ACF较高，可能源于其与靶细胞更强的相互作用或其他环境变量，但两种情况下HMM均通过伪残差拟合优度检验。

2.5 The Hidden Markov Models Capture the Behavior of the Original Dataset

为验证各T细胞群体拟合的HMM，使用拟合HMM模拟100个T细胞500个时间点的运动，并计算平均ACF。模拟时间窗口与实验数据集相同。单指数函数完美拟合模拟数据：低亲和力模拟T细胞时间衰减常数τ=1.92分钟，高亲和力τ=1.71分钟。低亲和力T细胞的拟合衰减常数更接近实验值（1.85分钟），高亲和力则差异稍大（1.63分钟），这种差异源于高亲和力模型步长自相关较强。两种情况下模拟数据的平均ACF与实验一致，拟合HMM在时间平均均方位移（TAMSD）方面也重现了实验数据行为。

3 Discussion

CD8⁺ T细胞在监视人体和清除病原体、癌细胞中起关键作用。T细胞基础癌症免疫疗法的快速发展要求更好地设计CD8⁺ T细胞，以有效探索肿瘤微环境并杀伤癌细胞。这需要通过适当调整T细胞在肿瘤微环境中的迁移实现，因此理解T细胞运动本质、可能子状态及其统计特性对优化癌症免疫疗法至关重要。

本研究分析了两种不同亲和力T细胞群体在B16黑色素瘤肿瘤中的迁移行为，使用体外3D双光子显微镜成像。两种T细胞群体均显示双状态迁移：一个状态慢速类似随机游走，另一个状态快速且持久。尽管既往研究也观察到这些现象，但本研究提出了系统性算法和方法，用于严格识别迁移子状态数量、特性及状态间转换速率。

由于T细胞迁移的复杂性及其重要性，众多数学模型被提出描述其行为。研究表明初始T细胞遵循扩散或亚扩散随机游走，而激活后T细胞转向更复杂迁移动力学，包括弹道式快速迁移（具重尾位移分布）和更局部化（慢速）搜索。这导致使用Lévy行走模型描述脑组织感染中T细胞迁移，但该模型未能捕捉位移间自相关，与自然情况矛盾，且因似然函数误用受批评。Banigan等显示T细胞在脑感染模型中不遵循Lévy行走，而是慢速和快速运动状态组合，使用GMM；Jerison等采用速度-持久性耦合模型描述该行为。这些发现与黑色素瘤浸润CD8⁺ T细胞情况一致，但他们的模型未能捕捉状态间转换，而本研究通过HMM方法实现。此外，HMM可跨条件和平台应用，优于封闭方程形式。快速-慢速子状态的相似性提示T细胞迁移机制在感染和肿瘤间保守。

本分析结合GMM和HMM分析实体瘤中T细胞迁移，同时尽量减少假设。分析表明两种CD8⁺ T细胞均不服从纯布朗运动，正态性检验拒绝该假设；GMM验证了两状态共存，与Banigan等一致。该聚类方法的使用由位移弱自相关证明合理。发现低亲和力T细胞具有更长记忆性，可能源于其与靶细胞结合较弱，这也体现于其较大位移和角度分布集中，但状态间转换概率无差异。聚类分析识别了隐藏状态数量，用于HMM建模状态间动态转换。最终通过ACF重现和TAMSD曲线复现能力评估拟合模型。

理解CD8⁺ T细胞迁移有助于设计更好的癌症免疫疗法。分析严格表明T细胞以双状态模式迁移：慢速状态方向持久性低，快速状态持久性高，且单细胞可在状态间切换。可相应设计T细胞以浸润肿瘤微环境并接触靶细胞，从而有效监视区域。具体性质可能取决于肿瘤类型，例如实体瘤可能要求T细胞浸润后更多保持慢速状态，因靶细胞密度高。

尽管本算法应用于CD8⁺ T细胞，但相同方法可应用于其他细胞类型。然而需要更多平台测试以更好理解不同条件下CD8⁺ T细胞迁移。本算法的两个主要局限：GMM仅适用于细胞位移低自相关情况，若自相关较高，需使用动态时间规整（DTW）等其他聚类方法识别状态数量；其次未考虑外部因素（如其他细胞类型影响）和空间成分。总体而言，本方法能捕捉体外肿瘤组织中T细胞迁移特征，而不依赖封闭方程模型且假设较少。

4 Experimental Section

T Cell Migration in Mouse Melanoma Tumors Data

从转基因小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤获取四个数据集，通过体外双光子显微镜成像，数据先前由Tucker等发表。转基因小鼠产生识别肿瘤抗原酪氨酸酶相关蛋白2（TRP2）的低和高亲和力CD8⁺ T细胞。CD8⁺ T细胞从脾脏和淋巴结纯化，体外用白细胞介素-12（IL-12）刺激以防衰竭，随后静脉转移至小鼠。低和高亲和力CD8⁺ T细胞分别通过Brainbow tdTomato和UBC-GFP标识，用Imaris软件在3D中追踪，帧率32秒/帧。为减少偏差，仅允许连续时间点的轨迹进入分析，否则视为独立轨迹。总共分析N=271条低亲和力和N=266条高亲和力CD8⁺ T细胞轨迹，分别含5204和5067个时间点。因两群体迁移模式可能存在显著差异，故分开分析。高和低亲和力数据集总成像时间和时间窗口相似。

Statistical Analysis

计算每个细胞的时间平均均方位移（TAMSD）和位移自相关函数。假设3D位置时间序列有N个数据点，等间距时间滞后，每个向量对应细胞位置，使用重叠采样法估计MSD。通过位置数据集的一阶差分计算位移，获得去趋势时间序列。假设位移时间序列均值为零，这对去趋势数据集有效，其中每个细胞的自相关函数由相应公式给出。为评估群体水平自相关函数，基于每个细胞数据点数量计算加权平均ACF，95%置信区间由支持信息中的公式计算。

Gaussian Mixture Model

将高斯混合模型（GMM）应用于总CD8⁺ T细胞所有时间点的位移分布，以识别迁移状态数量。该聚类方法中，分布近似为M个高斯分布的线性叠加，其中混合系数需满足特定条件。本研究假设位移高斯均值为零且运动各向同性，因此分布公式可简化为特定形式。为识别使位移分布似然最大化的参数集，使用期望最大化算法。结合BIC、AIC和肘部法则决定状态数量。

Hidden Markov Model

为推断状态间动态转换参数，应用隐马尔可夫模型（HMM），使用R语言momentuHMM包结合moveHMM包修改脚本。隐藏状态数量由GMM聚类分析确定。模型观测变量为步长、转向角和z轴位移，假设分别服从伽马分布、von Mises分布和逻辑分布。其中转向角使用atan₂函数计算，约束在(-π, π]范围内。为估计参数，采用数值似然最大化方法。

Ethics Approval Statement

实验在无特定病原体条件下进行，符合相关法律和指南，经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准。

Acknowledgements

这项工作得到美国国立卫生研究院资助（R01 AI156276至B.T.F.，U54CA210190、U54CA268069和P01CA254849至D.J.O.）。Leica Stellaris 8 DIVE系统的多光子成像由NIH S10拨款1S10OD034456-01（至B.T.F.）支持明尼苏达大学免疫学中心实现。

Conflict of Interest

作者声明无利益冲突。