镰状细胞病患儿血清血红素加氧酶-1显著升高：来自非洲镰状基因组网络的新见解

本研究发现镰状细胞病（SCD）患儿血清血红素加氧酶-1（HO-1）水平显著高于成人，达三倍之多，且在6-10岁年龄组达到峰值。该研究通过对SickleGenAfrica队列中2309例患者分析，揭示了HO-1水平与年龄、基因型（Hb SS最高）、性别（男性较高）及羟基脲使用的关联，同时发现触珠蛋白（Hpt）和血红素结合蛋白（Hpx）普遍耗竭。这些发现提示HO-1可能在儿童期对血红素诱导的毒性起关键保护作用，为SCD的年龄特异性治疗策略提供了新视角。

　　

引言

镰状细胞病（Sickle Cell Disease, SCD）是一种以慢性血管内溶血为特征的遗传性血液疾病，其病理生理过程涉及细胞外血红素的释放。这种血红素分子具有强烈的促氧化、促炎和细胞毒性作用，它能激活内皮细胞上的Toll样受体4（TLR4），促进粘附分子表达、白细胞募集以及SCD核心并发症——血管阻塞的发生。在转基因镰状小鼠模型中，外源性血红素给药会增加炎症细胞因子表达，诱导心脏应激标志物，并导致血管阻塞和急性肺损伤，模拟了人类SCD的关键特征。临床研究表明，SCD患儿血浆血红素水平升高与需要住院治疗的血管阻塞危象风险增加2倍，以及急性胸部综合征（Acute Chest Syndrome, ACS）风险增加2.5倍相关。这些发现共同强调了血红素在SCD发病机制中的有害作用。

血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase-1, HO-1）通过将血红素降解为具有细胞保护作用的产物——一氧化碳和胆绿素，在中和血红素有害效应中扮演了关键角色。这是一种存在于所有细胞类型中的高度诱导型酶，其表达可被多种刺激因素上调，包括血红素本身、病原体和氧化剂。在转基因镰状细胞小鼠中，HO-1的保护作用已得到证实：抑制HO-1会加剧血管淤滞和血红素诱导的粒细胞浸润，而诱导HO-1则能对ACS模型产生保护效应。动物研究还提示，这种保护作用可能是年龄依赖性的：在血红素诱导的ACS模型中，年轻的纯合子SCD小鼠比成年小鼠表现出高得多的存活率，这与它们更快降解细胞外血红素的能力有关。此外，在氧化应激后，年轻小鼠的肝脏中HO-1被显著诱导，而年老小鼠则无此现象。在人类中，多项研究支持HO-1在SCD中的保护能力。例如，能够驱动强劲HO-1表达的HMOX1基因启动子等位基因变异与SCD患儿ACS相关住院率降低三倍有关。此外，HMOX1基因多态性也与不同SCD人群的血管阻塞危象频率、中风发生率、住院率、肾病和胎儿血红蛋白水平相关。

尽管HO-1在SCD病理生理中的重要性已得到认可，但据我们所知，尚无研究检测人类SCD患者的血清HO-1水平。虽然在与炎症和氧化应激相关的其他疾病中已有HO-1水平升高的记录，但缺乏对SCD患者HO-1水平的研究值得进一步 investigation。本研究利用SickleGenAfrica队列的数据，旨在检查SCD个体中不同年龄组的HO-1表达模式。我们还分析了HO-1水平与性别、SCD基因型和羟基脲使用的关系。此外，我们评估了触珠蛋白（Haptoglobin, Hpt）和血红素结合蛋白（Hemopexin, Hpx）的水平，这是另外两种已知因慢性溶血而在SCD患者中显著耗竭的细胞保护性清除蛋白。

材料与方法

研究人群

总计2309名患有SCD的儿童和成人通过SickleGenAfrica网络入组，他们来自加纳的两个中心：阿克拉和库马西，入组时间为2018年至2021年。研究获得了阿克拉的加纳大学、库马西的恩克鲁玛科技大学和科姆福·阿诺克耶教学医院的伦理批准。非SCD参与者（血红蛋白AA, AS, CC和AC）被排除在研究之外。此外，患有罕见SCD表型（血红蛋白SD和SE）的患者因其在研究队列中代表性极低而被省略。剩余的SCD参与者被分为四种亚型：血红蛋白SS病（Hb SS）、血红蛋白SC病（Hb SC）、镰状细胞β+地中海贫血（Hb Sβ+ thalassemia）和血红蛋白S-遗传性胎儿血红蛋白持续存在症（Hb S-HPFH）。羟基脲的使用情况由成年人自我报告，儿科患者则从医院记录中提取。

实验室分析

所有血液样本均在常规门诊访视时采集，当时患者处于疾病稳定状态。样本立即进行处理，组分储存于-80°C。血红蛋白表型通过毛细管电泳（Sebia, Capillarys 2 Flex-Piercing系统）测定。血清血红素结合蛋白和触珠蛋白水平通过标准比浊法（Siemens, Atellica NEPH 630）测量。血清HO-1浓度通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）确定。

统计分析

参与者按年龄（<16岁和≥16岁）分层，组间差异使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量的中位数，使用Pearson卡方检验比较分类变量。为了更好地可视化HO-1水平的年龄相关趋势，患者被分为5岁间隔的组别，所有40岁以上的患者由于数量有限合并为一组。使用Kruskal-Wallis检验评估年龄组间HO-1水平的差异，事后分析采用Bonferroni校正的配对Wilcoxon检验。采用Bootstrap法估计中位数的标准误用于图形表示。我们使用分层亚组分析来比较不同患者特征（包括性别、SCD亚型和羟基脲使用）的HO-1水平（以中位数和四分位距[IQR]表示），包括总体和按年龄组分层的分析。由于HO-1水平呈非正态分布且正偏态，我们使用非参数方法进行比较：两组比较使用Wilcoxon秩和检验，多组比较使用Kruskal-Wallis检验。所有P值均使用Bonferroni校正进行多重比较调整。

作为敏感性分析，我们进一步进行了多变量线性回归分析，以评估观察到的差异是否独立于混杂因素。HO-1水平作为连续结局变量，年龄、性别、SCD亚型、羟基脲使用以及溶血标志物——触珠蛋白和血红素结合蛋白——作为预测因子。我们使用广义方差膨胀因子（GVIF）评估预测因子之间的多重共线性，GVIF值>5被认为存在共线性。

统计分析使用R版本4.3.1进行。

结果

人口统计学和临床特征

该研究包括了2309名SCD参与者，其中53%为女性。中位年龄为12岁（IQR：6-24岁），有1381名参与者（60%）年龄在16岁以下。SCD亚型分布为：Hb SS（n=1322; 57%）、Hb SC（n=688; 30%）、Hb Sβ+地中海贫血（n=71; 3.1%）和Hb S-HPFH（n=228; 9.9%）。

年龄相关的HO-1、Hpx和Hpt水平模式

HO-1水平存在显著的年龄依赖性模式，最高水平见于6-10岁年龄组。青少年和成年人的中位HO-1水平显著较低，从11-15岁参与者的65.4 ng/mL（IQR：24.7–132 ng/mL）下降到16-20岁参与者的25.7 ng/mL（IQR：8.55–75.4 ng/mL）。这种模式在亚组中保持一致，包括性别和SCD亚型。总体而言，16岁以下儿童的中位HO-1水平（69.8 ng/mL; IQR：29.8–137.6 ng/mL）比16岁及以上的成年人（23.1 ng/mL; IQR：7.8–62.4 ng/mL）高出三倍。这种年龄相关模式在所有亚组中都是一致的。

血红蛋白和血红素清除蛋白Hpt和Hpx在所有患者中均呈耗竭状态，这与先前的SCD报告一致。这两种蛋白在16岁以下患者中的水平显著低于成年人。儿童的中位Hpt水平为0.105 g/L（IQR：0.065–0.177 g/L），而成年人为0.123 g/L（IQR：0.078–0.223 g/L）。同样，儿童的中位Hpx水平为0.205 g/L（IQR：0.126–0.389 g/L），而成年人为0.274 g/L（IQR：0.135–0.475 g/L）。

HO-1水平的亚组分析

男性显示总体HO-1水平显著高于女性（中位数：52.4 vs. 44.8 ng/mL）。在SCD亚型中，Hb SS患者表现出显著高于Hb SC患者的总体HO-1水平（中位数：63.2 vs. 29.4 ng/mL）。使用羟基脲的参与者（占7.7%）其HO-1水平显著高于未使用者（中位数：78.4 vs. 46.2 ng/mL）。

HO-1水平预测因子的多变量分析

经调整后，HO-1水平每增加一岁下降1.04 ng/mL，男性比女性高19.89 ng/mL。较高的Hpx水平与较低的HO-1相关。Hb SC患者的HO-1显著低于Hb SS患者。然而，与Hb SS相比，Hb Sβ+ thal或SS/S-HPFH患者在HO-1水平上未观察到显著差异，这可能源于这些亚组参与者数量有限。羟基脲使用未显示显著关联，表明未经调整的分析中存在混杂。该模型解释了HO-1水平约5%的变异性（调整后R2=0.05）。GVIF值均<1.2，表明变量间无共线性。这些发现支持了HO-1水平与年龄、性别和SCD亚型之间关联的稳健性。

讨论

这项对来自加纳的2309名SCD个体的研究揭示了关于血清HO-1模式的几个显著发现。儿童表现出比成年人高三倍的中位HO-1水平，峰值出现在6-10岁年龄组，并在青春期至成年早期之间急剧下降。这种模式在不同的SCD亚型、性别和羟基脲使用情况下保持一致，表明HO-1存在独特的年龄依赖性调节。

15岁后HO-1水平的急剧下降可能反映了随年龄增长溶血负担的逐渐减少以及生物反应能力的年龄相关性变化。儿童中HO-1水平升高可能代表了对该年龄组更严重溶血的反应，因为HO-1是一种可由血红素和氧化应激上调的诱导型酶。多项横断面和纵向研究表明，溶血标志物——包括胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶和网织红细胞计数——在儿童和青少年SCD患者中高于成人，支持了溶血在年轻患者中更为严重的观点。我们的数据进一步表明，相对于其溶血负担，儿童可能产生了更强劲的HO-1反应。

先前的研究表明，SCD小鼠模型中的血浆和肝脏HO-1水平均高于对照组，这表明血清HO-1可能作为溶血应激下组织水平HO-1活性增加的替代标志物。尽管HO-1经典上是一种细胞内酶，但其在血清中的存在可能反映了从应激或受损细胞中的释放。这种解释仍然是推测性的，因为尚未证实HO-1在血清区室中直接酶解血红素。

尽管如此，SCD动物模型支持了诱导HO-1在应对溶血应激中的细胞保护作用。在转基因镰状小鼠中，激活NRF2——HO-1的关键转录调节因子——会导致血清HO-1水平升高、溶血稳定、内皮损伤减少以及对血红素诱导的ACS的保护。在这些模型中，HO-1的上调与改善的临床结局相关，包括存活率提高、肺水肿减少和组织学损伤减轻。这些保护效应可被HO-1的药理抑制所 abolish，强调了其在介导对溶血诱导损伤的抵抗力中的功能作用。这一逆转已在额外的临床前研究中得到证实，加强了HO-1作为血红素毒性关键调节因子的证据。

此外，虽然先前的研究报告称SCD儿童经历的血管阻塞危象较少（18岁以下儿童每100人年53.91次事件，而成人为142.20次），并且在ACS中通常有更好的结局，但这种模式也可能反映了慢性疾病中随年龄增长疾病相关并发症的预期积累，而非HO-1的直接保护效应。因此，我们的解释应被视为探索性和假设生成性的，需要在纵向研究中进一步 investigation。

尽管尚无HO-1水平的既定标准，但我们SCD队列中的总体中位HO-1水平（48.5 ng/mL; IQR：15.1–102 ng/mL）与健康人群报告的水平相比显著升高，后者通常中位HO-1水平低于2.5 ng/mL。这代表了这种诱导型酶大约20倍的增加，表明了对SCD中慢性溶血、炎症和氧化应激的保护性反应。

在不同SCD亚型中观察到的HO-1水平差异——Hb SS患者显著高于Hb SC患者——与该疾病已知的临床严重程度谱一致。HO-1是一种诱导型酶。Hb SS患者中升高的HO-1水平可能代表了对更严重溶血和血红素负荷的补偿性反应，这可能减轻了血红素诱导的细胞毒性。在没有溶血典型相关的其他炎症疾病中，如急性COVID-19感染、各种急性炎症性肺部疾病、结核病和急性缺血性中风，已有血清HO-1水平升高与疾病严重程度和预后相关的报告。

我们的研究还证实了SCD个体中Hp和Hpx水平的耗竭，这与先前显示这两种蛋白浓度相较于年龄匹配对照组显著降低的报告一致。其他研究进一步证明，这种耗竭在不同年龄组和SCD基因型中持续存在。中位Hpt水平低于为非洲成年人群建立的参考范围以及一般成年人群的参考范围。类似地，Hpx水平与正常参考范围相比也降低了。此外，与我们研究中的成年人相比，16岁以下患者的Hpt和Hpx水平显著更低。这些清除剂的稀缺强调了补偿性上调HO-1以应对SCD中细胞外血红素增加的潜在保护作用，尤其是在可能更依赖HO-1的儿童中。

男性在所有年龄组的HO-1水平均显著高于女性。这可能归因于对更严重溶血的上调反应，因为已知男性在儿科和成人人群中均经历更高的溶血率以及某些SCD并发症（如血管阻塞危象）的更高发生率和严重程度。在其他疾病中对血清HO-1水平的研究未报告男女之间的显著差异，可能源于这些疾病中缺乏溶血以及性别间炎症程度的差异。

在多变量线性回归的敏感性分析中，HO-1水平与年龄、性别和SCD亚型的关联保持相似，表明这些关系即使在调整了潜在混杂因素后仍然存在。

仅有7.7%的参与者报告使用羟基脲，且大多数使用者（178人中的158人）是16岁以下的儿童。尽管在单变量分析中羟基脲使用者的HO-1水平似乎更高，但这种关联在多变量模型中无统计学意义。这些发现表明，观察到的差异很可能被年龄和SCD亚型所混淆。羟基脲在该队列中的使用在年轻患者中更常见，他们总体上有更高的HO-1水平，并且在Hb SS个体（Hb SS患者的7.9%）中比在Hb SC个体（仅2%）中更频繁。由于Hb SS患者也比Hb SC患者有更高的HO-1水平，未经调整的分析中明显的关联可能反映了适应症混淆。尽管我们的发现在调整后不支持羟基脲使用与HO-1水平之间的独立关联，但先前在SCD小鼠模型中的研究表明，羟基脲给药会增加血浆HO-1水平和肝脏HO-1产量。此外，已有报道称羟基脲可诱导SCD患者炎症细胞中的HO-1基因表达。尽管存在这种生物学合理性，但我们队列中羟基脲使用者数量少及其人口统计学偏斜可能限制了我们检测此种效应的能力。

局限性

我们的研究有几个局限性。首先，横断面设计限制了我们评估个体患者HO-1随时间变异的能力，并且无法建立因果关系。其次，我们没有测量临床终点，如血管阻塞危象或ACS发作的频率，这限制了我们直接将HO-1水平与疾病严重程度相关联的能力。第三，可能影响HO-1水平的潜在混杂因素——如并发感染、营养状况或其他SCD并发症的存在——未在我们的分析中加以考虑。此外，生存偏倚可能影响年龄相关模式；患有更严重疾病和潜在更高HO-1水平的患者可能无法存活到成年，导致在成年人群中观察到的中位HO-1水平较低。然而，在不同亚组中一致的年龄相关HO-1模式为我们