糖尿病肾病患者尿液外泌体miRNA表达谱分析及其与肾损伤的关联研究

本研究通过分析糖尿病肾病（DKD）患者尿液外泌体miRNA表达谱，鉴定出40种差异表达miRNA，并首次报道miR-371a-3p等6种miRNA与DKD相关。功能分析显示这些miRNA参与细胞凋亡和纤维化通路，体外实验证实DKD来源外泌体可诱导足细胞凋亡和肾小管上皮细胞胶原合成，为DKD早期诊断和治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。

　　

引言

糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）作为糖尿病最常见的微血管并发症，是全球终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因。当前临床诊断主要依据估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR < 60 mL·min^?1·1.73 m^?2）或尿白蛋白肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio, UACR ≥ 30 mg/g）的异常，但这些指标缺乏特异性。外泌体作为携带蛋白质、脂质、mRNA和microRNA（miRNA）的纳米级囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用。尿液外泌体因其稳定性和特异性，成为研究DKD病理机制的理想生物标志物来源。

材料与方法

研究选取经肾活检确诊的20例DKD患者、20例无DKD的2型糖尿病（type 2 diabetes, T2DM）患者和15例健康对照者。通过超速离心法分离尿液外泌体，透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）鉴定外泌体形态和粒径，Western blot检测表面标志物CD63和CD9。采用Illumina测序平台进行miRNA测序，通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）验证差异表达miRNA。利用miRanda算法预测靶基因，并进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。体外实验用人足细胞（human podocyte cells, HPCs）和肾小管上皮细胞（human tubular epithelial cells, HK-2）分别处理正常对照（NC-Exo）、糖尿病（DM-Exo）和DKD来源外泌体（DKD-Exo），通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡，Western blot检测凋亡和纤维化相关蛋白表达。

结果

临床资料

DKD组HbA1c、血清肌酐（serum creatinine, SCr）、总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）和尿ACR显著高于DM组和NC组，eGFR显著降低。肾病理显示DKD患者存在肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生和炎性细胞浸润等特征性改变。

外泌体鉴定

TEM显示外泌体呈杯状半球形结构，直径40-100 nm；NTA测定平均直径为137.9±57.2 nm；Western blot证实外泌体表达CD63和CD9蛋白。

miRNA表达特征

miRNA测序发现40种差异表达miRNA，其中17种为已知miRNA，23种为新发现miRNA。已知miRNA在DKD组均下调，包括首次报道的miR-371a-3p、miR-371a-5p、miR-1260b、miR-222-3p、miR-1224-5p和miR-1253。RT-qPCR验证了miR-371a-3p、miR-371a-5p、miR-483-5p和miR-124-3p的显著下调。

GO与KEGG分析

GO分析显示靶基因涉及生物过程、分子功能和细胞组分；KEGG分析提示这些基因参与135条通路，包括Toll样受体、MAPK、PI3K/Akt、p53和钙信号通路，以及FOXO和凋亡信号通路等。与凋亡相关的通路包括Bcl-2结合组件3和PI3K/Akt信号通路，与纤维化相关的包括NF-κB和MAPK信号通路。

外泌体摄取

PKH67标记的外泌体可被HPCs和HK-2细胞摄取，3小时开始吸收，24小时达到峰值，激光共聚焦显微镜显示外泌体定位于细胞质。

DKD-Exo对足细胞活力和凋亡的影响

CCK-8检测显示DKD-Exo显著降低足细胞活力，流式细胞术显示DKD-Exo组凋亡率显著增加。Western blot检测到DKD-Exo组Bax/Bcl-2比值和cleaved caspase-3表达显著升高。

DKD-Exo对HK-2细胞胶原合成和转分化的影响

Western blot显示DKD-Exo组Collagen I和fibronectin（FN）蛋白水平显著升高，α-SMA（alpha smooth muscle actin）在DM-Exo和DKD-Exo组均显著升高。

讨论

本研究首次系统分析了经肾活检确诊的DKD患者尿液外泌体miRNA表达谱，发现40种差异表达miRNA，其中6种为首次报道。生物信息学分析提示这些miRNA参与凋亡和纤维化相关通路。体外实验证实DKD来源外泌体可诱导足细胞凋亡和肾小管上皮细胞胶原合成，表明尿液外泌体在DKD病理机制中发挥重要作用。本研究为DKD的早期诊断和治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。

研究局限性

本研究缺乏在高糖（high glucose, HG）条件下的体内外验证，测序样本量较小，且为横断面研究，缺乏纵向临床结局验证其预后价值。

结论

DKD患者尿液外泌体存在差异表达miRNA，这些miRNA参与凋亡和纤维化信号通路。DKD来源外泌体可促进足细胞凋亡和肾小管上皮细胞胶原合成，提示尿液外泌体可能作为DKD的非侵入性生物标志物和治疗靶点。