马达加斯加榕属植物化学多样性的变异来源：器官功能与系统发育的交互作用

本研究通过非靶向代谢组学（UHPLC-MS）和系统发育分析，揭示了马达加斯加榕属植物叶片和未成熟果实（syconium）的化学多样性主要受器官特异性功能驱动，且存在中等程度的系统发育信号。研究发现，同一器官在不同物种间的化学相似性高于同一物种内的不同器官，表明代谢谱的收敛与适应功能（如防御、信号传递）密切相关，为理解植物次生代谢物（secondary metabolites）的进化与生态功能提供了新视角。

　　

Abstract

Premise

植物产生种类繁多的次生化合物，这些化合物在种间和种内相互作用以及适应环境变化中至关重要。化学多样性被认为与多种因素有关，包括与草食动物或传粉者的相互作用、组织特异性需求以及进化限制。然而，驱动植物化学多样性的众多因素之间的相互作用尚不清楚，主要是因为大多数研究只关注单一器官（主要是叶片），或者在比较不同器官时仅限于单一分类群。因此，功能因素与系统发育因素之间的关系仍未解决。本研究以马达加斯加的榕属（Ficus）为模型系统，探讨植物化学多样性在多大程度上受组织特异性功能的影响，以及系统发育亲缘关系在多大程度上解释了果实和叶片化学多样性的变异。

Methods

研究采用非靶向代谢组学方法，分析了来自马达加斯加热带雨林的八个野生榕树物种的未成熟果实（syconium，一种包含众多小花的中空结构）和叶片。使用超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS）表征其化学谱，并使用六个遗传标记重建系统发育树，以理解化学多样性的模式。

Results

果实和叶片的代谢组与其它物种的同一器官更为相似，而非同一物种内的不同器官。果实和叶片的化学多样性存在显著但中度的系统发育相关性。

Conclusions

尽管系统发育亲缘关系影响马达加斯加榕属植物的化学多样性，但组织特异性代谢物的功能收敛可能是主要的进化驱动因素。

MATERIALS AND METHODS

Model system and sample collection

样本采集于马达加斯加东部Ranomafana国家公园的Talatakely地区。研究了该地点生长的所有八个榕属物种。叶片样本在采集后立即用硅胶干燥，并运至德国进行DNA提取、Sanger测序和系统发育重建。所有样本的植物标本凭证存放在马达加斯加Fianarantsoa省Ranomafana村附近的Centre ValBio研究站。

共收集了60个果实和叶片样本用于代谢组学分析。数据集包括来自八个榕属物种的28个混合果实样本和32个混合叶片样本。每个样本代表从单株树上采集的混合果实或叶片，旨在获取每个个体的代表性样本，从而捕获同种树木之间的变异，同时最小化不在本研究范围内的个体内变异。

Preparation of samples for ultra-performance liquid chromatography mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis

使用改进的标准方案从叶片和果实中提取非靶向代谢物。器官样本使用陶瓷珠在组织匀浆器中研磨成细粉，与提取缓冲液混合，并加入IAA-缬氨酸作为内标。混合物经过离心，上清液合并并稀释，随后进行HPLC分析。

Liquid chromatography mass spectrometry

使用Ultimate 3000标准超高效液相色谱系统（UHPLC）进行样本分离，采用Acclaim Rapid Separation Liquid Chromatography (RSLC) 120 C18柱。洗脱的化合物使用电喷雾电离-超高分辨率-四极杆-飞行时间质谱仪（ESI-UHR-Q-ToF-MS）在正离子模式下检测，数据依赖的碰撞诱导解离（Auto-MS/MS模式）用于获取更丰富的碎片信息。

Data processing

LC-qToF-MS数据使用Bruker Compass MetaboSpace Mass Spectrometry Software进行分析。T-ReX算法用于质量重新校准、峰拾取、峰对齐、完整特征提取以及同位素、加合物和电荷状态的分组。保留在至少50%的某一组（标记为Species_tissue）样本中存在的特征。应用特征过滤器排除在ACN或空白样本中出现的特征，最终得到13,269个用于叶片和果实样本的特征。

Reconstructing Ficus phylogeny

分子遗传数据集包括六个DNA标记区域：核核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）、外转录间隔区（ETS）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3pdh）、颗粒结合淀粉合酶（GBSSI）、核编码叶绿体表达的谷氨酰胺合成酶（ncpGS）和镁-原卟啉IX单甲基酯（氧化）环化酶（At103）。新生成的数据与先前对桑科的系统发育工作数据相结合。

Statistical analyses

所有统计分析使用R version 4.3.3进行。使用基于Bray–Curtis相异性的非度量多维标度（NMDS）视觉检查数据，然后应用置换多元方差分析（PERMANOVA）。使用vegan中的Mantel检验函数测试系统发育相关性，旨在确定亲缘关系较近的物种在代谢上是否更相似。

RESULTS

Chemical similarity between fruits and leaves

在UHPLC-MS谱中，在果实中发现了约11,960个特征，在叶片中发现了12,480个特征。其中绝大多数（11,353个特征）在叶片和果实之间共享。果实有604个独特特征，叶片有1125个独特特征。果实的独特特征主要存在于莽草酸、苯丙烷和萜类途径中，而叶片的独特特征则高度体现在莽草酸、苯丙烷和生物碱途径中。

对检测到的特征进行聚类分析显示，几乎所有果实样本聚集在一起，几乎所有叶片样本聚集在另一个分支上。因此，跨物种来看，果实的代谢特征更倾向于与其它物种的果实相似，而不是与同一物种的叶片相似，反之亦然。当分析同一物种不同器官的代谢物时，发现果实与叶片之间的代谢物在同一物种内聚类，显示出物种和器官之间的显著差异（PERMANOVA物种效应，df = 7, R² = 0.156, pseudo-F = 5.243, P < 0.001）。唯一的例外是Ficus polita，其叶片和果实与其它研究物种的差异如此之大，以至于它们被分组在一个单独的簇中。

Phylogenetic effects on chemodiversity

比较榕属系统发育树与基于果实和叶片代谢组数据的层次聚类树，发现系统发育与果实化学多样性（Pearson r = 0.4022, P = 0.037962）和叶片化学多样性（Pearson r = 0.5512, P = 0.004995）之间存在中度正相关且显著，相关性基于Bray–Curtis相异性。

DISCUSSION

使用来自马达加斯加田野采集的八个榕属物种的模型系统，研究了果实和叶片在化学上更类似于同一物种内的不同器官，还是更类似于其它物种的同一器官，以及进化历史（亲缘关系）在多大程度上解释了果实和叶片代谢物组成的器官特异性变异。研究发现，跨物种的植物化学谱收敛以及物种的系统发育关系解释了果实和叶片化学多样性的一部分。这一发现表明，叶片化学比果实化学在进化上更为保守。这种差异可能反映了器官特异性的进化压力或生态功能的差异。

研究揭示，果实和叶片倾向于在特定器官跨物种间化学上更为相似，而不是在同一物种的器官间。这一发现强烈支持植物次生代谢物的适应作用，特别表明果实次生代谢物不仅仅是叶片代谢的“泄漏”结果（即不仅仅是叶片代谢的副产品），而是为果实中的特定功能而进化出来的。此外，果实和叶片具有 distinct 的代谢特征；果实独特地富含萜类相关化合物，而叶片则更多地与生物碱途径相关。这种差异与它们不同的对抗者相一致：叶片面临草食动物，而未成熟果实必须防御种子捕食者。

研究结果并未明确支持解释植物中超化学多样性的任何主要假说的预测。所有三个假说——协同作用（synergy）、代谢筛选（screening）和生态相互作用（interaction diversity）——都暗示化学多样性具有适应作用。研究结果通过证明即使是尚未与种子传播者相互作用的未成熟果实，也显示出跨物种的强烈化学收敛，从而强烈支持了这一作用。

研究发现果实和叶片化学多样性存在中度的系统发育效应。果实化学较弱的（但仍然统计显著的）信号（r = 0.4）可能表明其具有更大的进化不稳定性，可能是由于来自传播者和种子捕食者的选择压力。对于叶片化学，略强的相关性（r = 0.55）可能反映了营养组织中保守的防御策略，这些组织暴露于长期的草食行为，并且较少需要为另一个发育阶段（如准备成熟的未成熟果实）建立代谢组。

研究结果因所使用的模型系统和结合的系统发育与群落方法而得到加强。这八个物种属于一个单一的属，如果共享的祖先在植物化学多样性中起主要作用，预计会存在化学多样性的相似性。这八个物种生长在土壤因素相似的同一森林中，因此避免了错误地将源于环境条件的变异归因于系统发育。

CONCLUSIONS

研究提供证据表明器官化学多样性与器官类型密切相关，表明特定的化学功能。它还探讨了系统发育对化学多样性的潜在影响，因为这些因素可能是生态相互作用和植物化学多样性进化的未被充分认识的驱动因素。研究发现叶片和果实化学谱都具有中度的系统发育相关性，表明虽然进化关系影响植物代谢组，但其它生态和环境因素对化学多样性也有显著贡献。总而言之，研究结果展示了驱动植物化学多样性的因素的复杂性。

AUTHOR CONTRIBUTIONS

多位作者在数据管理、形式分析、可视化、验证、方法论、项目管理、软件以及审阅/编辑手稿方面做出了贡献。N.M.v.D.和O.N.负责资源、资金获取和监督。L.M.N.N.和O.N.撰写了初稿。R.R.R.和K.V.负责马达加斯加的项目管理和资源。所有作者阅读、编辑并批准了最终版本的手稿。

ACKNOWLEDGMENTS

该项目由DFG（德国科学基金会）资助。感谢Ranomafana国家公园和Centre ValBio、MICET的工作人员对我们进行研究提供的支持和帮助。感谢多位专家学者对系统发育分析、物种鉴定、代谢组学结果以及分析系统发育信号提供的宝贵意见和协助。也感谢审稿人和编辑的建设性反馈和支持。