亚马逊蓝藻源抗菌与细胞毒性生物活性化合物的发现及其机制研究

本文推荐一篇关于亚马逊蓝藻生物活性成分的系统研究，揭示了其提取物和组分在抗菌（MIC/MBC）、细胞毒性（MTT/IC50）和化感作用方面的潜力。研究通过UPLC-HRMS/MS鉴定出脱镁叶绿酸（pheophorbide）和脱镁叶绿素（pheophytin）衍生物为关键活性分子，并证实了菌株协同效应和培养基优化（ASM/CHU-10）对酚类化合物和藻胆蛋白（PBP）生产的显著影响，为天然产物药物和生物技术应用提供了新资源。

　　

摘要

亚马逊蓝藻作为光合微生物，以其多样的生物活性化合物生产能力而备受关注。本研究系统评估了亚马逊蓝藻提取物及组分的生物活性，包括色素和酚类化合物的生产。来自Synechococcussp. CACIAM 05的一个组分（C5FD）对hCMEC/D3和MG-63细胞表现出细胞毒性。通过UPLC-HRMS/MS分析，该组分中的脱镁叶绿酸和脱镁叶绿素衍生物被鉴定为关键生物活性分子。在抗菌试验中，同一菌株的另一组分（C5FB）对Bacillus subtilisATCC 6633表现出杀菌活性，最小抑菌浓度（MIC）为40 μg mL^?1。其他菌株也显示出抗菌效果，但MIC较高。化感活性试验鉴定出11个具有生物活性的菌株，包括Desmonostocsp. CACIAM 45和Synechocystissp. CACIAM 05之间的协同效应。Lyngbyasp. CACIAM 07和Desmonostocsp. CACIAM 45的水提取物显示出最高的总酚含量（TPC）。Desmonostocsp. CACIAM 45在不同培养基中的培养表明，CHU-10和ASM是酚类和藻胆蛋白（PBP）生产的最佳培养基。这些发现揭示了亚马逊蓝藻的新生物活性和代谢特征，支持其作为药物和生物技术应用天然产物宝贵来源的潜力。

1 引言

蓝藻是地球上最古老的产氧光合生物，化石记录可追溯到35亿年前。这些光合微生物广泛分布于淡水、海洋和陆地环境，并能在极端条件下生存。次级代谢产物的生产是科学界研究的主要策略之一，这些天然产物化学多样性高，具有独特的结构特征，并表现出广泛的生物活性，包括抗癌、抗病毒、杀菌和杀藻活性。

1970年至2019年间，约1630种由蓝藻产生的独特分子被识别，分布在260个家族中，以肽类结构为主。全球蓝藻培养物收藏的增加促进了对该群体形态和遗传多样性的更好理解，但针对其化学成分和生物活性潜力的研究仍然有限，仍是一个未探索的具有发现未知次级代谢产物高潜力的来源。在亚马逊雨林，这方面的知识更为稀缺。

亚马逊地区拥有地球上最大的河流盆地和热带雨林，包含多种生态系统。蓝藻是亚马逊盆地微生物群落的重要组成部分，尤其是固氮物种，它们是这些生态系统中必需的氮源。此外，它们可以是底栖生物和浮游动物种群的食物来源。对亚马逊生物群的系统研究使得新属的发现成为可能。一些菌株的基因组含有与适应过程相关的生物合成基因簇，例如那些赋予重金属抗性和生产萜类、细菌素、非核糖体肽和聚酮化合物的基因簇，突出了它们作为新型天然产物来源的潜力。

基于上述背景，亚马逊蓝藻和微藻收藏（CACIAM）于2010年建立。该培养物收藏位于生物分子技术实验室和酶生物技术与生物转化实验室（巴西帕拉联邦大学贝伦生物科学研究所），收藏有约80株主要从淡水中分离的蓝藻菌株。虽然一些研究探索了这些菌株的脂肪酸剖面用于生物燃料生产及其酶活性，但对其生物活性潜力的调查仍然稀缺。

因此，本研究旨在评估CACIAM蓝藻的细胞毒性、抗菌、化感和抗氧化潜力，并测定其提取物的总酚和藻胆蛋白（PBP）含量。此外，通过高分辨率电喷雾电离质谱联用液相色谱（HPLC–HRESIMS）进行非靶向代谢组学分析，鉴定了细胞毒性组分中的生物活性化合物。

2 结果与讨论

2.1 系统发育分析

菌株CACIAM 45最初根据其与 Nostocales 目形态相似性被分类。基于16S rRNA基因并结合GenBank参考序列的系统发育分析显示，CACIAM 45和Desmonostocsp. PCC 8306在一个高度支持的分支（99.40% bootstrap）中密切 related，该分支还包括Desmonostocsp. PCC 8107和Desmonostocsp. DS1。这些显著的遗传和进化联系通过这种强大的系统发育分组突出显示，指向Desmonostoc属内的共同祖先和相似特征。

2.2 细胞毒性

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法评估了蓝藻Desmonostocsp. CACIAM 45和Synechococcussp. CACIAM 66提取物对HepG2肝癌细胞、HCT-116结肠癌细胞和hCMEC/D3脑内皮细胞的细胞毒性效应。水和甲醇提取物在12.5至200 μg mL^?1的浓度范围内表现出低或可忽略的细胞毒性，表明细胞毒性化合物的存在极少。

对天然来源新生物活性化合物的研究通常从粗提物开始，然后进行活性引导的分级分离。虽然这种方法有助于发现新的次级代谢产物，但由于粗提物的化学复杂性而面临挑战，这可能导致观察到的生物活性归因于多种化合物的联合效应而非单一纯化化合物，可能导致假阳性结果。预分级可以通过减少化合物之间的拮抗相互作用和增强单个代谢物的活性来缓解这些问题。基于这一原理，我们还在筛选工作中包括了组分。

CACIAM 05、CACIAM 45和CACIAM 66的甲醇（MeOH）提取物被分级以进行进一步分析。MG-63骨肉瘤细胞系被用作代表性癌症细胞模型。在25 μg mL^?1浓度下，来自CACIAM 05提取物的D组分（指定为C5FD）对MG-63和hCMEC/D3细胞系表现出最高的细胞毒性。

2.3 Synechocystissp. CACIAM 05 D组分的代谢组学分析

在C5FD组分中发现的主要化合物的m/z为623.28487（Rt: 11.14）和m/z653.2931（Rt: 11.47）。这两种化合物在GNPS数据库中没有对应的匹配。同样的化合物在菌株Gloeothecesp. LEGE 16572、Limnoraphis robustaLEGE XX358和一个未鉴定的Synechococcales（LEGE 15546）的细胞毒性组分中被检测为主要成分。作者通过手动搜索天然产物词典和研究其MS2裂解模式，将这些代谢物鉴定为13-羟基-脱镁叶绿酸a甲酯和15-羟基-内酯-脱镁叶绿酸a乙酯。在较小量中，另一个m/z为639.29020的脱镁叶绿酸在C5FD中被检测到，并被鉴定为151-羟基-内酯-脱镁叶绿酸a甲酯。值得注意的是，该化合物也在同一菌株活性较低的C组分中被遇到，但强度更高。这些发现表明，该代谢物可能对D组分中观察到的细胞毒性活性贡献很小。

脱镁叶绿酸和脱镁叶绿素是与C5CD组分中观察到的抗增殖特性相关的化合物家族，是已知具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗增殖特性的叶绿素降解产物。这些代谢物可以通过消化蔬菜获得，并且由于其光敏性，已被探索用于光动力疗法。这些代谢物的抗癌潜力已在不同的癌细胞系中被广泛研究，显示出显著的抑制活性，IC₅₀值约为0.5 μM。

C5FD组分的UHPLC–HRMS/MS数据使用Mzmine工具进行预处理，随后提交到GNPS平台。在D组分中检测到的母离子用于生成基于特征的分子网络。每个特征代表一个m/z、保留时间和MS²谱。这些特征基于其相关MS/MS谱的相似性被组织在子网络中——也称为分子家族或簇。这种方法依赖于结构相关的分子在MS²分析中通常表现出相似裂解模式的原则。显示足够独特MS²谱且不与其他分子分组的特征被分类为单例。

C5FD组分的化学成分主要以四吡咯及其衍生物为特征，这些是观察到的组分细胞毒性活性的原因。其他化学组群被识别，如肽、大环内酯、酚和脂质；然而，这些组群内的特定化合物未被识别。

2.4 抗菌潜力

评估了组分对革兰氏阴性菌Salmonella typhimuriumATCC 14021、革兰氏阳性菌Bacillus subtilisATCC 6633和酵母Candida parapsilosis的抗菌特性。所研究的组分均对酵母和革兰氏阴性菌没有生物活性。具有最高抗菌活性的组分来自菌株Synechocystissp. CACIAM 05（C5FB），其次是来自Desmonostocsp. CACIAM 45的组分C45FC（09.76 ± 0.12 mm）。Synechococcussp. CACIAM 66（C66FD）显示出08.68 ± 0.35 mm的抑制圈，与组分C45FB（08.70 ± 0.23）相当。琼脂扩散试验的结果与肉汤微量稀释法中观察到的结果一致。C5FB组分显示出40 μg mL^?1的最小抑菌浓度（MIC）值和80 μg mL^?1的最小杀菌浓度（MBC）值，表明存在杀菌化合物。组分C45FC表现出80 μg mL^?1的MIC值和160 μg mL^?1的MBC值，而其余组分表现出低抗菌活性，MIC值高于160 μg mL^?1。

本研究中对革兰氏阴性菌和酵母缺乏拮抗活性的记录也与Martins等人报道的一致，他们评估了几种海洋蓝藻的水和有机溶剂提取物对一组革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及酵母Candida albicans的活性。作者测试的提取物均未对革兰氏阴性菌和酵母产生抑制效应。这些事实可能与革兰氏阴性菌中存在外膜和酵母中存在几丁质细胞壁有关，这阻碍了有毒物质的进入。真菌细胞壁作为抗性因子也被Humisto等人记录，他们评估了蓝藻肽hassallidin D的作用机制。该化合物对哺乳动物细胞和酵母均显示出有害效应，半最大效应浓度（EC₅₀值存在非常显著的差异。报告的C. albicansEC₅₀值为31 ± 3.0 μM，而哺乳动物细胞为4.8 ± 0.56 μM。

Synechococcales目蓝藻的抗菌化合物生产报道频率低于丝状蓝藻。在本研究中，来自该群体的两个菌株——Synechococcussp. CACIAM 66和Synechocystissp. CACIAM 05——显示出抗菌活性。尽管这些微生物已知拥有比丝状蓝藻更小的基因组，因此生物合成基因簇数量更有限，但它们可能受益于其某些酶的混杂性，例如LanM型羊毛硫氨酸合成酶。这种双功能生物催化剂对于羊毛硫肽的成熟至关重要。单个LanM酶可以作用于多个前体肽，使得能够在同一菌株内生产同一家族的不同分子。此外，编码该酶的基因已在几种Synechococcus和Prochlorococcus物种的基因组中被识别。

来自CACIAM 05菌株的组分对其靶标表现出选择性。例如，C5FD组分对乳腺细胞表现出细胞毒性，但即使在较高浓度下也无法抑制细菌生长。这种选择性可能源于化合物对一种或多种特定细胞成分的依赖性。例如，从土壤蓝藻Desmonostoc muscorum发现的脂肽Muscotoxin A需要胆固醇来发挥其裂解活性，主要靶向哺乳动物细胞。尽管其高细胞毒性，细菌膜中胆固醇的缺失可能解释了其有限的抗菌活性。在hassallidin D的变体中观察到类似的胆固醇依赖性，其作用谱排除革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。

使用细菌生长曲线测定进一步评估了C5FB组分的杀菌活性。从12小时培养物收集的B. subtilis细胞以1 × 10^?5 CFU mL^?1的最终浓度接种在Mueller–Hinton（MH）培养基中。孵育2小时后，细胞暴露于不同浓度的组分。如先前观察到的，80 μg mL^?1的处理在不到1小时内导致完全细胞死亡。在40 μg mL^?1时，该组分表现出抑菌效应，细菌生长仅在6小时后恢复，在16小时达到最大吸光度。记录的吸光度（0.06）大约是对照（0.55）的九倍。在20 μg mL^?1时也记录了抑菌效应，尽管生长减少不太明显。

2.5 化感潜力

在评估化感潜力的蓝藻菌株中，丝状类型被识别为化感化合物的主要来源。在固体培养基中的共培养显示，11个菌株能够生产此类化合物。由于Synechocystissp. CACIAM 05、Desmonostocsp. CACIAM 45和Synechococcussp. CACIAM 66共享相同的环境起源；CACIAM 05和CACIAM 45被单独和组合测试以研究可能的协同效应。当单独测试时，CACIAM 05和CACIAM 45对CACIAM 66的生长没有抑制影响。然而，它们的组合导致显著的抑制效应，抑制圈为33.3 mm，表明潜在的协同相互作用。菌株CACIAM 53表现出最高的拮抗潜力，抑制圈为47.43 mm，而Cyanobiumsp. CACIAM 16和CACIAM 66（针对Microcystis aeruginosaCACIAM 03测试）最低，分别为18.87和12.87 mm。

在化感测定中观察到的丝状和单细胞蓝藻之间的约束可以通过这两组之间基因组大小的差异来解释。丝状蓝藻通常拥有比单细胞蓝藻更大的基因组。因此，它们拥有更多的生物合成基因簇，这些通常与化感化合物的生产相关。本研究中调查的所有蓝藻都源自淡水环境。这些蓝藻已被认可为一种未探索但丰富的杀藻化合物来源。从这些微生物中发现的代谢物包括从菌株Oscillatoriasp. LEGE 05292提取的portoamides；在底栖蓝藻Fischerella muscicolaUTEX 1829的上清液中识别的fischerellin；从Stigonematales目蓝藻分离的hapalindole型生物碱，以及在Calothrix菌株的二甲基亚砜（DMSO）提取物中发现的calothrixins。

尽管菌株CACIAM 45、05和66来自相同的背景，但无法确认这种类型的相互作用在自然环境中发生。这是由于测定中使用的高生物量浓度，这通常存在于蓝藻水华和大多数化感研究中。然而，本研究强调了一些亚马逊菌株用于水华控制的潜力。来自该地区的微生物因其生物技术潜力仍未充分探索，并且是发现新生物活性化合物的有希望候选者。

几项研究表明，探索微生物之间的相互作用可以导致隐秘天然产物的发现。这些物质通常不在标准实验室条件下生产或以如此小的量合成以至于难以检测。CACIAM 05和CACIAM 45之间的相互作用使得具有杀藻特性的化合物生产成为可能，当菌株单独评估时未观察到这种效应。类似现象被Shi等人报道，他们观察到真菌Cladosporiumsp. WUH1生物合成二苯醚作为对细菌B. subtilisCMCC(B) 63501产生的抗真菌环肽的防御反应。在另一项研究中，发现菌株M. aeruginosaFACHB-905在与目标生物绿藻Chlorella vulgaris接触时增加其杀藻化合物亚油酸的释放。微藻释放的一氧化氮刺激了该化合物的生产。

使用不同类型提取物和浓度进行的测定揭示了Nostocsp. CACIAM 21和CACIAM 53之间不同的化感行为。对于Nostocsp. CACIAM 21，显著的抑制活性仅在水提取物（C21）中观察到，在500 μg mL^?1浓度下产生23.9 ± 0.95 mm的抑制圈。这表明该菌株中的活性化感化合物可能是水溶性的。相反，CACIAM 53在相同浓度（500 μg mL^?1）下对其任何提取物均未显示抑制效应。然而，当浓度增加到1000 μg mL^?1时，二氯甲烷-甲醇（2:1）提取物（C53）显示出10.14 ± 0.51 mm的抑制圈。这表明极性较小的化合物可能发挥化感效应，但仅在高浓度下。在蓝藻属中，Nostoc被认为是最有前途的，因为它生产结构多样的分子，具有各种生物活性特性，包括杀藻剂如nostocine A和nostocyclamide。

2.6 总酚含量

通过Folin–Ciocalteu方法评估了水和有机提取物的总酚含量（TPC）。表3显示了从菌株Lyngbyasp. CACIAM 07、CACIAM 45和CACIAM 66获得的TPC值，以每毫克干提取物的没食子酸（GA）当量表示（μg没食子酸当量[GAE] mg^?1干提取物）。最高的TPC在菌株CACIAM 45的乙醇提取物中观察到（39.24 ± 1.58 μg GAE mg^?1干提取物），其次是其甲醇提取物（26.88 ± 0.42 μg GAE mg^?1干提取物）。除Synechococcussp. CACIAM 66外，乙醇提取物显示出比甲醇和水提取物更高的TPC值。

水提取物的产率值与Morone和Favas等人观察到的一致。这些作者报告的TPC水提取物范围从6.52 ± 0.38到15.67 ± 0.23 μg GAE mg^?1干提取物，而在我们的研究中，它们范围从8.94 ± 0.12到15.43 ± 1.37 μg GAE mg^?1干提取物。提取物之间观察到的差异可归因于各种酚类物质化学多样性的差异。蓝藻是这些化合物的丰富来源，并且即使在物种水平上也表现出相当大的化学成分变异。

乙醇已广泛用于多酚提取，而甲醇被认为适用于提取较低分子量的多酚。本研究中使用不同溶剂从生物质获得的产率与另一项研究报道的匹配，其中溶剂极性越大，提取产率越高。

关于使用不同类型溶剂从干生物质获得的提取物产率，水提取物在菌株之间变化最小，产率范围从61.15%到64.85%。甲醇提取物产率第二高，而乙醇提取物表现出最低产率。这在Desmonostocsp. CACIAM 45中特别明显，记录产率仅为7.06%。

尽管乙醇提取在Lyngbyasp. CACIAM 07和Desmonostocsp. CACIAM 45中导致比水和甲醇更高的酚含量，但相对于干生物质的低提取产率降低了其整体有效性。因此，这些菌株的酚含量每克干生物质分别为3.97 ± 0.02和2.77 ± 0.11 mg GAE g^?1。这些值远低于同一菌株水提取物中发现的值，分别达到10.01 ± 0.89和10.66 ± 0.32 mg GAE g^?1干生物质。

类似结果由Vega等人报道，他们评估了不同溶剂对酚类化合物提取的影响。用水进行的提取导致比用乙醇进行的提取更高的TPC值。他们研究中使用的Lyngbyasp.菌株产生大约8 mg GAE g^?1干生物质的TPC值。这些结果与Morone等人报道的一致，他们评估了使用水和酮作为溶剂获得的蓝藻提取物的TPC。虽然酮提取物在每克提取物测量时表现出更高的TPC，但水提取物在基于干生物质重量评估时表现更好，主要由于其更大的提取产率。

CACIAM 45中升高的TPC促使评估四种生长培养基——BG-11、ASM、Chu-10和AA——以评估它们对TPC生产的影响。其中，ASM导致酚类化合物的最高生产，达到22.45 μg GAE mg^?1干提取物，其次是Chu-10，为19.28 μg GAE mg^?1。相比之下，BG-11和AA效果较差，它们之间没有显著差异（p≥ 0.05）。这些发现将ASM确定为增强CACIAM 45中酚类化合物生物合成和抗氧化活性的最有效培养基。

2.7 PBP含量测定

在CACIAM 45生长在不同培养基下研究的其他成分包括PBP。超过14天，菌株调整其代谢过程，导致其化学成分的改变。本研究中使用的培养基基于其组成差异选择，特别是硝酸盐和磷酸盐浓度。两种元素对光合过程都有强烈影响，因此可以显著影响碳固定及其分配到各种大分子类别中。CHU-10和ASM培养基产生最高浓度的PBP。除藻红蛋白（PE）外，两种培养基之间没有统计学显著差异。两者支持非常相似浓度的藻蓝蛋白（PC）（分别为59.09和59.60 μg mg^?1干水提取物）和别藻蓝蛋白（20.52和20.76 μg mg^?1干水提取物）。PE浓度显示轻微变化。虽然CHU-10培养基产生59.19 μg PE μg mg^?1干水提取物，但在ASM培养基中生长导致55.8 μg mg^?1干水提取物的生产。

除AA培养基外，PC与PE的比例在不同培养基中保持不变，保持接近1:1的比例，表明藻胆体包含相等数量的PE和PC盘。这些变化在水提取物的颜色中视觉上明显。从AA培养基生长的细胞提取物显示蓝色调，而从其他培养基收集的提取物仅显示轻微颜色差异。

CHU-10和ASM培养基表现出与BG-11和AA培养基相比最低的硝酸盐浓度，并且在目前的研究中，为PBP生产提供了最有利的条件。氮剥夺已被广泛用于增强次级代谢物的合成。某些在无氮环境中生长的蓝藻菌株，如Anabaenasp. NCCU-9和Anabaenasp. 7120，显示出改善的PBP生产，如和分别指出。然而，对于一些特定菌株，去除氮可能导致生长和色素生产的显著减少。

蓝藻通常利用亚硝酸盐、硝酸盐和铵作为氮源。该元素对于氨基酸生物合成至关重要，这反过来负责蛋白质形成，包括PC的线性四吡咯。氮剥夺也可能导致PBP的降解，因为这些色蛋白作为氮储备，导致快速细胞漂白。在Desmonostocsp. CACIAM 45的情况下，异形细胞的存在和使用盛宴和饥荒策略可能有助于缓解由氮缺失引起的应激。该策略包括在营养丰富的环境中生长菌株短暂时间（“盛宴”），随后在更营养耗尽的培养基中生长（“饥荒”）。

2.8 抗氧化活性

合成抗氧化剂已广泛用于各个工业部门，特别是在食品和化妆品行业。这些化合物有效中和自由基，从而阻止或减缓氧化过程。这一特性有助于增强各种产品的风味、香气、颜色和保质期。然而，最近的讨论提出了与合成抗氧化剂潜在健康风险的担忧。因此，对天然抗氧化剂的兴趣日益增长，这些来自有机材料，如植物、微藻、动物和细菌。这些天然替代品不仅为人类健康提供优势，而且还有潜力通过利用可再生资源促进循环和环保经济。

在我们的研究中，我们使用2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）清除测定评估了CACIAM 07、CACIAM 45和CACIAM 66水提取物的抗氧化潜力。当抗氧化分子存在时，这种自由基被还原和中和，导致无色或淡黄色乙醇溶液。由于其敏感性和低成本，该方法已被广泛用于研究来自不同来源的酚类化合物和提取物的自由基清除特性。

CACIAM 45表现出最高的DPPH清除活性，IC₅₀值约为1.25 mg mL^?1。源自该菌株的水提取物表现出无细胞毒性并有效抑制微生物生长，同时具有高TPC值。这些特性使该微生物成为化妆品和食品行业应用的有希望候选者。此外，在提取过程中使用水有助于降低溶剂成本并最小化对人类健康和环境的潜在风险。

3 结论

本研究探索了从亚马逊地区分离的蓝藻的生物技术潜力。分析的菌株显示出有希望的生物活性特性，特别强调CACIAM 05，它表现出显著的细胞毒性和抗菌活性。观察到的细胞毒性效应归因于脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸衍生物的存在。

此外，CACIAM 45通过其显著的酚类化合物和PBP含量脱颖而出。此外，该提取物表现出无细胞毒性，将其定位为食品和化妆品行业应用的有希望候选者。值得注意的是，在所调查的蓝藻中一致观察到化感化学品的生产。

总之，这些发现不仅扩展了我们对亚马逊蓝藻生物技术潜力的理解，而且强调了调查这一独特区域内微生物群的重要性。

未来的研究应继续深入调查这些生物体，以发现新的代谢途径并利用其全部潜力进行创新生物技术应用。

4 实验部分

4.1 培养菌株

本研究中使用的所有蓝藻均选自亚马逊蓝藻和微藻收藏（CACIAM），位于帕拉联邦大学（巴西帕拉贝伦）生物研究所。表S1展示了这些微生物的一般特征。这些蓝藻菌株从亚马逊地区的两个湖泊中回收：Tucuruí水电站水库（3°50′04.9″ S, 49°42′32.2″ W）和Bolonha湖（1°25′00.7″ S, 48°25′52.6″ W），均位于巴西帕拉。

4.2 DNA提取、扩增（PCR）和测序

本研究首次识别了一种蓝藻，最初与另一种蓝藻一起