LCN2-ACOD1信号通路通过介导铁死亡（Ferroptosis）调控骨骼肌损伤后再生机制的研究

本文揭示了脂质运载蛋白2（LCN2）及其下游靶基因乌头酸脱羧酶1（ACOD1）在骨骼肌损伤修复中的关键作用。研究表明，该信号通路通过诱导线粒体功能障碍和铁死亡（一种铁依赖性的脂质过氧化细胞死亡方式），显著抑制成肌细胞增殖与分化。靶向ACOD1可有效缓解铁死亡并促进肌生成，为骨骼肌再生障碍和相关肌肉疾病提供了新的治疗策略。

　　

摘要

骨骼肌的正常生长发育对维持机体功能至关重要。在成肌细胞发育过程中，细胞死亡是基本的生理过程，而骨骼肌损伤涉及多种细胞死亡类型，包括铁死亡（Ferroptosis）。然而，铁死亡在骨骼肌损伤中的相关生物标志物仍不明确。本研究旨在探讨铁代谢关键蛋白脂质运载蛋白2（LCN2）是否通过介导铁死亡来调控损伤后骨骼肌的再生。

引言

骨骼肌是支持身体结构、控制运动和储存能量的重要器官。细胞死亡作为细胞生命周期的一部分，是成肌细胞发育中的基本生理过程，涵盖从胚胎发育、器官维持、衰老到免疫反应协调等多个方面。通常情况下，骨骼肌中的多种生理过程处于稳态，部分得益于细胞死亡的精确调控。然而，当骨骼肌受损时，除了最近发现的铁死亡外，凋亡、坏死和自噬共存，共同影响骨骼肌的再生、稳态和完整性。铁死亡因其在众多疾病发展中的作用而成为研究热点，例如癌症、心血管疾病、肝脏相关疾病和退行性疾病。此外，越来越多的报告表明铁死亡与骨骼肌损伤和肌病之间存在密切联系，这表明靶向铁死亡来调控骨骼肌再生具有广泛意义。

铁死亡的特征是由铁超载和活性氧（ROS）的产生引发的严重脂质过氧化。其中，细胞内铁水平由铁摄取、储存、释放和代谢决定。铁代谢的关键蛋白LCN2（也称为铁钙蛋白或24p3）通过结合Fe²⁺（全息-24p3）并通过内吞作用将其转运至细胞内，或者以独立形式（载脂蛋白-24p3）进入胞质结合Fe²⁺并将其转运至细胞外。作为铁死亡的调节因子，LCN2在多种疾病中扮演重要角色，例如肺癌、结直肠癌和中枢神经系统疾病。近年来，LCN2在肌肉代谢中的作用逐渐被揭示。相关研究表明，LCN2是骨骼肌损伤后再生的调节因子。然而，很少有研究阐明LCN2通过介导铁死亡来调控损伤后骨骼肌再生的具体机制。本研究在C2C12成肌细胞中过表达LCN2后进行RNA测序，筛选出差异最显著的差异表达基因（DEGs），即乌头酸脱羧酶1（ACOD1）。

ACOD1介导衣康酸的产生、氧化应激和抗原处理，并在免疫和疾病中扮演双重角色。ACOD1存在于线粒体中，并被证明可以调节线粒体来源的ROS以及细胞内的ROS产生。这些发现表明ACOD1通过调节ROS产生在塑造免疫反应中具有双重作用。此外，由于ROS介导的脂质过氧化是铁死亡过程的关键因素，因此假设ACOD1作为LCN2的下游信号分子，可能通过介导线粒体相关的铁死亡来调控损伤后骨骼肌的再生。

材料与方法

本研究使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过向腓肠肌（GAS）注射1.2% BaCl₂溶液建立急性骨骼肌损伤模型。在损伤后1天（1 d）、3天（3 d）、5天（5 d）、7天（7 d）和9天（9 d）收集组织和血液样本进行组织学分析、蛋白质和基因表达检测。C2C12细胞系用于体外实验，细胞在生长培养基（DMEM + 10% FBS）中培养，达到80%融合后转换为分化培养基（DMEM + 2%马血清）。使用铁死亡诱导剂Erastin（Era, 5 μM）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1, 10 μM）和ACOD1抑制剂（ACOD1-IN, 20 μM）处理细胞。通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光染色、透射电镜（TEM）、ROS和Fe²⁺检测等方法评估铁死亡和相关信号通路的变化。通过RNA测序和生物信息学分析筛选LCN2过表达后的差异表达基因。

结果

3.1 BaCl₂激活急性损伤和骨骼肌再生

注射BaCl₂后1天，受损肌细胞开始溶解并出现炎症反应。损伤后3天，肌纤维受损最严重，表现为大量较小尺寸的肌纤维和最小的横截面积（CSA）。中性粒细胞迅速侵入受损区域，单核细胞迅速分化为巨噬细胞，浸润在损伤后3天达到峰值并逐渐减少。巨噬细胞在促进损伤修复中发挥主导作用，包括吞噬受损肌肉组织和细胞碎片，产生促炎和抗炎细胞因子以调节炎症。损伤后5天，含有两个或多个中央核的肌纤维显著可见，组织基本在损伤后9天愈合。从损伤1天到3天，结缔组织中的成纤维细胞开始合成和分泌胶原纤维，到5天时胶原纤维合成达到峰值，随后逐渐恢复以重建受损肌肉组织。肌肉发育标志物配对盒7（Pax7）、成肌决定因子（MyoD）和肌细胞生成素（MyoG）的表达水平随着GAS损伤逐渐增加，随后随着再生恢复正常水平。这些数据表明BaCl₂激活了组织降解和再生的协调过程。

3.2 铁死亡参与骨骼肌损伤模型及LCN2的表达模式

形态上，与正常线粒体相比，损伤后3天骨骼肌中的线粒体呈现典型的铁死亡特征，如膜密度增大、体积减小、嵴减少甚至消失。机制上，损伤后3天血清Fe²⁺含量和铁代谢相关指标核受体共激活因子4（NCOA4）和铁蛋白轻链（FTL）的表达显著上调，意味着损伤通过促进铁蛋白降解增加了铁池中的游离铁。脂质过氧化物MDA的含量和促进脂质过氧化物生成的脂质代谢酶长链脂肪酰辅酶A合成酶4（ACSL4）的表达在损伤后3天显著增加。抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在损伤后1天和3天显著下调，在5天时显著上调以参与修复。修复完成后，上述指标逐渐恢复正常水平。

此外，与铁死亡相关的关键因子LCN2的表达水平在损伤后1天迅速增加，且先于铁死亡相关指标的变化，随后逐渐减弱。LCN2的受体24p3R的变化与LCN2一致。此外，我们观察到LCN2主要定位于受损的肌纤维中。因此，铁死亡参与了小鼠骨骼肌损伤，且在损伤最严重时期参与度最高，而LCN2的变化发生在铁死亡发生之前。

3.3 LCN2参与通过铁死亡抑制C2C12成肌细胞增殖

为了阐明铁死亡对成肌细胞增殖的影响，使用铁死亡诱导剂Erastin诱导C2C12成肌细胞的铁死亡。与0.01% DMSO组相比，CCK-8结果显示C2C12成肌细胞的活力与Erastin浓度呈负相关，选择5 μM Era进行后续细胞实验。C2C12成肌细胞随后单独用5 μM Era处理或在1至20 μM浓度的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1存在下处理。Fer-1剂量依赖性地逆转了Era对细胞活力的抑制作用。基于现有研究经验，选择10 μM Fer-1用于后续实验。Era刺激后，C2C12成肌细胞中的Fe²⁺含量和FTL表达水平显著增加，表明游离铁积累。Solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）和GPX4表达的下调表明抗脂质过氧化作用被破坏从而驱动铁死亡。MDA含量和ACSL4表达增加，表明氧化还原稳态紊乱和脂质过氧化 overload。然而，这些变化通过Fer-1补充得以逆转。这些数据表明Era诱导了C2C12成肌细胞的铁死亡。

EdU染色用于追踪增殖细胞，显示Era诱导的铁死亡降低了EdU阳性细胞的比例和MyoD mRNA水平。有趣的是，LCN2表达水平在Era处理的增殖C2C12成肌细胞中增加。综上所述，当Era诱导的铁死亡发生时，C2C12成肌细胞的增殖受到抑制，而LCN2参与了上述过程。

3.4 LCN2是通过铁死亡减弱C2C12成肌细胞分化的关键因素

当细胞密度达到80%时，将生长培养基（GM）更换为含有5 μM Era（含或不含抑制剂Fer-1）的分化培养基（DM）。含有化学物质的培养基每天更新一次。细胞分化5天后，当铁死亡被激活时，细胞中的Fe²⁺、ROS和脂质过氧化产物MDA显著上调。此外，响应Era的SLC7A11显著下降导致GPX4表达抑制。ACSL4的上调最终通过促进脂质过氧化破坏氧化还原稳态来触发铁死亡。这些可以通过Fer-1来挽救。

对分化1、3和5天的细胞进行肌球蛋白重链（MYHC）的细胞免疫荧光（IF）染色显示，铁死亡激活后分化的细胞显著减少，意味着可用于肌管融合的细胞减少。分化5天的成肌细胞的融合指数以及肌管直径也显著降低。所有这些效应都可以被Fer-1挽救。与增殖的成肌细胞类似，当铁死亡激活时，LCN2在分化的成肌细胞中显著上调。可以得出结论，LCN2与通过铁死亡受损的C2C12成肌细胞分化相关。

3.5 LCN2参与通过铁死亡抑制C2C12肌管形成

为了精确了解铁死亡是否影响肌管形成，在分化5天后，C2C12肌管用5 μM Era单独处理或在10 μM Fer-1存在下处理。我们测量了铁死亡的标志物，结果显示Era处理的肌管中的ROS水平和Fe²⁺含量高于0.01% DMSO组。此外，FTL和ACSL4的蛋白表达水平在Era处理下增加，而两个重要的抗脂质过氧化生物标志物SLC7A11和GPX4的表达水平下降。这些结果验证了Era诱导了C2C12肌管中的铁死亡。

肌源性标志基因MyoG和肌球蛋白重链3（Myh3）的mRNA表达水平、从成肌细胞到肌管的终末分化、融合指数和肌管直径随着Era显著降低，这表明C2C12肌管形成受到Era诱导的铁死亡损害。值得注意的是，响应Era，LCN2及其受体24p3R的表达水平显著上调，表明LCN2在Era诱导的铁死亡抑制C2C12肌管形成中起关键作用。

3.6 LCN2敲低有效削弱Era诱导的C2C12成肌细胞铁死亡

为了研究LCN2在铁死亡调控中的作用，我们评估了LCN2敲低对Era刺激的C2C12成肌细胞铁死亡的影响。通过qRT-PCR和Western blot检测LCN2在mRNA和蛋白水平的敲低效率，结果显示敲低效率良好，因此可用于后续实验。此外，si-LCN2抑制了由于Era引起的24p3R上调。LCN2敲低显著降低了ROS、Fe²⁺和脂质过氧化产物MDA的水平。此外，就铁死亡相关指标而言，与era+si-NC C2C12细胞组相比，LCN2敲低组显示ACSL4蛋白表达水平显著降低，SLC7A11和GPX4蛋白表达水平显著更高。这些结果表明LCN2基因缺陷抑制了Era诱导的C2C12成肌细胞铁死亡的发生。

3.7 LCN2通过促进铁死亡抑制肌源性因子的表达

为了系统研究LCN2是否通过介导铁死亡影响骨骼肌再生及其具体机制，将小鼠pcDNA3.1或pcDNA3.1+LCN2载体转染到C2C12成肌细胞中。48小时后，我们提取RNA并进行RNA测序和转录组分析。我们通过qRT-PCR和Western blot检测了LCN2过表达效率，显示过表达良好。RNA测序结果显示，LCN2增加了352个基因的表达，降低了216个基因的表达。重要的是，在DEGs中显著上调且差异最显著的基因是Acod1。在其他DEGs中，RNA测序结果还显示LCN2上调了编码Ccl5、Rnaste2b、Polr2g、Hdc、Ptprj、Loxl3和Nupr1的基因，并抑制了编码STAT1、Col6a2、Usp18、Notch1和Adam8的基因，这些数据也通过qRT-PCR验证。通过KEGG数据库进行的GSEA显示DEGs富集于“氧化磷酸化”、“FoxO信号通路”和“铁死亡”等通路。GO生物过程术语富集于骨骼肌细胞氧化还原平衡和代谢稳态的失调，其中上调的基因涉及氧化磷酸化、氧化应激反应、花生四烯酸和长链脂肪酸代谢过程，而下调的基因涉及谷胱甘肽过氧化物酶活性、骨骼肌细胞增殖和肌管分化。考虑到花生四烯酸是铁死亡相关脂质过氧化的主要底物之一，本研究特别关注铁死亡相关基因。因此，我们通过qRT-PCR分析验证了RNA-seq数据中的铁死亡相关基因，结果显示LCN2增加了血红素氧合酶1（Hmox1）、Ncoa4、Ftl、铁蛋白重链（Fth1）和Gpx4的mRNA表达，降低了溶质载体家族39成员14（Slc39a14）和谷胱甘肽合成酶（Gss）的表达。标准化富集得分（NES）为1.6 > 0，意味着铁死亡信号通路上调。进一步，我们的测试显示肌生成相关指标MyoD和MyoG的mRNA和蛋白水平下降，表明LCN2通过激活铁死亡特征抑制了肌源性因子的表达。ACOD1蛋白水平的上调得到验证，因为它定位于线粒体，在线粒体中扮演重要角色。总之，这些发现暗示LCN2通过促进铁死亡抑制骨骼肌细胞生长，这可能与LCN2上调ACOD1有关。

3.8 ACOD1作为LCN2的效应子促进线粒体相关铁死亡

为了进一步证实LCN2-ACOD1通路与铁死亡之间的关系，在过表达LCN2后向C2C12成肌细胞添加20 μM ACOD1-IN。即使在ACOD1-IN处理的成肌细胞中，LCN2蛋白表达仍然升高，而ACOD1蛋白表达的增加被ACOD1-IN减少。LCN2的过表达确实加剧了铁死亡，表现为ACSL4蛋白表达水平增加和GPX4蛋白表达水平下降。此外，LCN2下调了SOD的活性，增加了MDA含量、Fe²⁺和细胞内ROS，所有这些都被ACOD1-IN逆转。此外，ACOD1-IN缓解了LCN2对细胞活力的抑制作用。总之，这些结果表明LCN2通过上调ACOD1加剧铁死亡，从而减弱成肌细胞的肌生成潜力。

据报道，ACOD1定位于线粒体，这也在我们的研究中得到确认。线粒体也是驱动铁死亡的ROS的主要来源。由LCN2-ACOD1信号触发的铁死亡被假设与线粒体功能障碍相关。电压依赖性阴离子通道2（VDAC2）的蛋白水平在过表达LCN2后显著增加，VDAC2是参与线粒体物质运输的关键组成部分。这种效应在很大程度上被ACOD1-IN逆转，这意味着ACOD1引起线粒体物质代谢的失调以及氧化还原平衡的扰乱。接下来，我们分别通过JC-1和MitoSOX确定了LCN2刺激的C2C12成肌细胞对MMP和超氧化物产生的影响。发现JC-1聚集体/单体比率的降低显著减弱，表明响应LCN2-ACOD1信号的MMP降低。类似地，与过表达LCN2相比，添加ACOD1-IN后线粒体中脂质过氧化产物的积累较低。这些数据表明ACOD1作为LCN2的效应子，在C2C12成肌细胞中诱导线粒体功能障碍介导的铁死亡。

总之，这些数据强烈支持LCN2通过上调ACOD1促进线粒体功能障碍相关铁死亡。ACOD1的抑制缓解了LCN2诱导的铁死亡，并改善了骨骼肌细胞的再生过程。

讨论

程序性细胞死亡，如凋亡、自噬和坏死，是由外部因素引起的响应骨骼肌损伤。这些过程在损伤/再生肌肉中共存，包括神经肌肉疾病患者的肌肉，例如炎症性肌病、营养不良、代谢和线粒体肌病以及药物诱导的肌病。随着这些发现，一种独特形式的程序性细胞死亡——铁死亡，逐渐被揭示与骨骼肌的损伤修复和再生过程相关。在老年啮齿动物和人类肌肉减少症的卫星细胞（SCs）中，Tfr1的缺陷通过激活铁死亡破坏骨骼肌再生，这一过程伴随着TFR1-SLC39a14-铁轴的功能转换。在衰老或损伤条件下，胱硫醚γ-裂解酶/氢 sulfide（CSE/H2S）信号的下调将有助于铁死亡细胞死亡并增强小鼠骨骼肌中的全局蛋白乙酰化。在CTX诱导的肌肉再生模型中，铁死亡相关标志物ACSL4和Hmox-1的表达增加，随后铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）和UAMC-3203抑制了肌肉再生相关基因MyoD和MyoG的表达，表明铁死亡可能介导肌肉再生。与上述结果一致，我们的研究揭示了铁死亡特征，例如线粒体的形态变化、GAS中血清Fe²⁺和MDA含量的增加，以及骨骼肌损伤阶段1天和3天时NCOA4、Ftl和ACSL4表达的增加，而GPX4表达下降。需要注意的另一点是，研究检查并发现与其他常用的内参基因如β-actin和GAPDH相比，N-酰神经氨酸胞苷酰转移酶（CMAS）在肌肉再生过程中表现出相对稳定的表达。因此，我们采用CMAS作为肌肉再生过程中基因表达分析的内参基因。

铁死亡是一种可调控的细胞死亡形式，例如可以通过抑制系统 XC^? 来调控。Erastin，一种系统 XC^? 抑制剂和铁死亡诱导剂，代谢稳定，适用于体内和体外使用。C2C12、U57810和U23674小鼠系对Erastin敏感，其剂量依赖性地降低上述细胞的活力。这与我们将不同浓度Erastin应用于C2C12成肌细胞后的CCK-8结果一致。作为铁死亡诱导剂，系统 XC^? 活性通过结合SLC7A11被抑制，胱氨酸运输受损以降低GPX4表达和GSH合成，最终细胞无法及时清除脂质过氧化物，导致细胞膜损伤。因此，我们检测了用Erastin处理的C2C12成肌细胞和肌管中Fe²⁺、MDA和ROS含量的上调，以及SLC7A11和GPX4的下调和FTL和ASCL4表达的上调。此外，由Erastin触发的铁死亡抑制了C2C12成肌细胞增殖和肌管形成，这与之前的发现一致。

在本研究中，LCN2表达在Erastin诱导的C2C12成肌细胞和肌管铁死亡发生过程中显著上调，并且LCN2表达在早期损伤期间急剧升高，表明LCN2通过介导铁死亡参与调控骨骼肌再生。在生理和炎症条件下，LCN2已被确定为铁调节蛋白。在原核生物中，LCN2抑制细菌铁载体获取铁，从而抑制细菌生长。在哺乳动物中，一项使用软脑膜转移小鼠模型的研究表明，癌细胞利用LCN2来收集铁。此外，多项研究证明LCN2通过介导铁死亡可能代表治疗多种疾病的有价值靶点。LCN2通过激活NF-κB/STAT3轴促进谷氨酸诱导的线粒体介导的铁死亡，从而确认LCN2作为铁死亡的关键基因在缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的发展中起重要作用。在肺癌恶病质的实验模型中，检测到组织浸润中性粒细胞数量显著增加，这些细胞分泌高水平的LCN2以促进铁死亡和组织消耗。来自不同研究的证据是一致的，包括我们的发现，即在Erastin诱导的肝细胞癌和胰腺导管腺癌细胞铁死亡模型中检测到LCN2表达水平增强。近年来，LCN2作为一种急性期蛋白在骨骼肌代谢中的作用被揭示。与野生型小鼠相比，LCN2^?/?小鼠的卫星细胞激活和骨骼肌再生显著受损。然而，LCN2是否通过介导铁死亡调控骨骼肌肌生成及其具体机制尚不清楚。在这里，在C2C12成肌细胞中过表达LCN2后进行RNA测序。与GAS损伤后的结果一致，测序显示LCN2可以通过上调NCOA4促进游离铁增加并降低催化谷胱甘肽合成的Gss水平来促进铁死亡，而Gpx4的上调可能是对负向信号的抵抗反应。

我们的工作揭示ACOD1是LCN2促进铁死亡从而影响骨骼肌再生的效应子。ACOD1被认为是一种在衣康酸代谢中活跃的酶，主要存在于线粒体中。ACOD1表达异常与炎症反应、抗菌过程、肿瘤发生、神经退行性变化和胚胎植入相关。ACOD1通过促进细胞内ROS和mitoROS产生介导氧化应激。ROS被过量的Fe²⁺催化氧化脂质膜上的多不饱和脂肪酸（PUFAs）产生脂质过氧化物，进而引发铁死亡。据报道，ACOD1调节铁死亡以影响乳腺癌转移，这与我们在LCN2过表达后用ACOD1-IN处理的C2C12成肌细胞中铁死亡下调的发现一致。在应激条件下，特别是炎症刺激下，先天免疫系统中的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞上调ACOD1表达。而且，细胞因子（例如干扰素β1 [IFNB1]、干扰素-γ [IFNG]）和小分子药物（例如HMOX1的化学诱导剂）可以刺激ACOD1的表达。巧合的是，我们的转录组测序结果显示HMOX1在LCN2过表达后显著上调，但LCN2、HMOX1和ACOD1在调控损伤后骨骼肌再生中的具体关系需要进一步探索。

铁死亡和线粒体功能障碍有着不可分割的联系。骨骼肌富含线粒体，积极参与不同类型的调控细胞死亡机制，包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡、铁死亡和自噬。参与铁死亡的主要线粒体途径是多方面的；例如，线粒体参与mitoROS产生、铁积累、脂质和氨基酸代谢、谷氨酰胺分解、氧化还原状态调控和细胞抗氧化能力。最近的一项研究提出，线粒体对于Erastin或胱氨酸饥饿诱导的铁死亡是不可或缺的。这些发现证实LCN2参与了由于Erastin诱导的铁死亡对肌生成的抑制，并且我们发现当LCN2-ACOD1信号上调时MMP降低并且mitoROS积累。此外，VDAC2除了运输代谢物外，还参与氧化还原调控，因此VDAC2的上调意味着LCN2-ACOD1触发了线粒体对氧化应激的适应性反应。

结论

总之，我们的结果确认LCN2的表达水平与骨骼肌损伤显著相关，更重要的是，我们首次发现LCN2-ACOD1信号通过介导线粒体相关的铁死亡影响骨骼肌再生。综上所述，本研究阐明了损伤后骨骼肌再生的新机制，为针对肌肉相关疾病的治疗策略提供了新的靶点。