新型N2O2供体四齿席夫碱及其金属配合物的合成、表征与抗菌活性研究

本文首次报道了以洛美沙星和噻吩-2,5-二胺缩合合成的新型四齿席夫碱配体H2L及其与Cr(III)、Mn(II)、Co(II)的金属配合物。通过元素分析、摩尔电导率、磁化率、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、气相色谱-质谱（GC-MS）和热分析等手段证实了螯合过程。所有配合物均呈现八面体几何构型，光学带隙能量（Eg）计算表明配合物较配体具有更高的电导性。抗菌评价显示铬(III)配合物对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌效果最强。细胞毒性测试（MTT法）表明所有化合物对正常前列腺上皮细胞（PrEC）均显示显著毒性（IC50 = 6.30–10.43 μM），但缺乏选择性，限制了其抗癌应用潜力。

　　

引言

席夫碱因其多样的药理和生物活性长期受到科学界关注，其生物活性主要与强大的螯合能力和偶氮甲碱（─CH═N─）官能团的存在密切相关。研究表明席夫碱具有抗菌、抗真菌、抗氧化、抗炎、抗癌、除草和驱虫等多种治疗特性。除了生物作用外，席夫碱还作为催化剂、染料、颜料和聚合物稳定剂应用于工业领域。结构上，席夫碱可作为双齿、三齿、四齿或多齿配体与各种氧化态的金属离子配位，从而增强化学稳定性和生物活性。在药物领域，席夫碱金属配合物表现出增强的药理性能，包括抗菌、抗真菌、抗癌、抗病毒、抗惊厥和抗HIV活性。近期研究强调了席夫碱金属配合物在DNA相互作用研究、化学治疗、超分子化学、药物开发、材料科学和生物医学技术等领域的重要性。氟喹诺酮类作为一类重要的合成抗菌药物，对多种有害病原体有效，并且对四环素类、氨基糖苷类、青霉素类、头孢菌素类和其他抗生素耐药。洛美沙星是第三代氟喹诺酮类药物，对广泛的革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体具有显著疗效。文献调研表明，尚未有研究报道由洛美沙星和噻吩-2,5-二胺衍生的席夫碱的合成或生物学评价，因此本工作的新颖性在于合成了新的席夫碱N,N′-噻吩（双-1-乙基-6,8-二氟-7-(3-甲基哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸）（H₂L）及其与铬(III)、锰(II)和钴(II)的配合物。

材料与方法

使用的化学品均为分析纯试剂（AR）且具有最高可获得纯度。洛美沙星（LFX）、噻吩-2,5-二胺（thio-en）、氯化铬二水合物、氯化锰一水合物和氯化钴六水合物、重铬酸钾、硝酸银、无水乙醇、二甲亚砜（DMSO-d₆）和二甲基甲酰胺（DMF）分别由奥布尔制药工业公司、Sigma和Aldrich化学品公司提供。

席夫碱配体H₂L的合成通过LFX与thio-en在乙醇中缩合反应完成。将LFX（2 mmol, 1.562 g）和thio-en（1 mmol, 0.114 g）溶于50 mL乙醇溶液中，以冰醋酸为催化剂。反应混合物在连续搅拌下回流8小时。完成后，在冰水浴中冷却至0°C。通过真空过滤分离出浅黄色固体产物，用乙醇洗涤并在无水氯化钙上真空干燥。

金属配合物的合成：暗绿色的[Cr(H₂L)(H₂O)₂]Cl₃·4H₂O（1）通过将0.5 mmol (0.3890 g)的H₂L溶于30 mL无水乙醇与0.5 mmol (0.1589 g)的CrCl₃·2H₂O溶于20 mL乙醇混合制备。混合物回流10小时，沉淀经过滤并在无水氯化钙上真空干燥。浅黄色和浅绿色固体配合物[Mn(H₂L)(H₂O)₂]Cl₂·4H₂O（2）和[Co(H₂L)(H₂O)₂]Cl₂·5H₂O（3）采用上述相同方法，使用MnCl₂·H₂O和CoCl₂·6H₂O制备。

使用PerkinElmer 2400 CHN元素分析仪进行分析。金属和氯含量的测定采用Vogel教科书描述的方法。金属离子分数通过将固体产物转化为金属氧化物的重量测量法和原子吸收法估算。使用PYE-UNICAM SP 1900光谱仪。KBr压片中的FTIR光谱在4000–400 cm^?1范围内使用FTIR 460 PLUS分光光度计获取。TG-DTG研究在N₂气氛下，从室温到1000°C使用Shimadzu TGA-50H进行。样品质量在铝坩埚中充分称量。使用UV-3101PC Shimadzu电子光谱仪。吸收光谱在DMSO-d₆溶液中捕获。粉末材料的磁化率在室温下使用Sherwood科学磁天平和高伊天平测量，以Hg[Co(CSN)₄]为校准物。质谱使用Shimadzu GCMS-QP-1000EX (ESI-70ev)在0–1090范围内获取。熔点使用Buchi装置测定。H₂L及其配合物在DMF中的1×10^?3 M溶液的摩尔电导率在室温下使用CONSORT K410评估。

抗菌研究采用改良的圆盘扩散法评估对某些病原微生物的抗菌效果。使用革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和蜡样芽孢杆菌（GST4），以及革兰氏阴性菌株大肠杆菌和铜绿假单胞菌。使用穆勒-辛顿琼脂作为营养培养基。琼脂培养基灭菌后冷却至47°C，然后分别接种相应的细菌培养物。为确保化合物均匀扩散，在含有15 mL培养基的12 cm培养皿中，将薄的无菌琼脂覆盖层倒入主要接种的琼脂层上。将浸有测试化合物（在DMF中浓度为1.0×10^?3 M制备；每盘0.1 mL）的无菌5 mm直径滤纸圆盘小心放置在凝固琼脂表面。平板在37°C孵育20小时。通过测量抑制区直径（mm）量化抗菌效果。使用环丙沙星和阿米卡星作为阳性对照抗生素以验证细菌敏感性。每种化合物的百分比活性指数相对于标准抗生素产生的抑制区使用公式计算。

合成化合物对两种真菌物种白色念珠菌（OC10）和青霉（CM1）的抗真菌效果进行评估。两种真菌的纯培养物在4°C下保存在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，并保存在DAFE的菌种保藏库中。使用圆盘扩散法进行抗真菌测定。PDA平板接种标准化的真菌孢子悬浮液，然后放置浸有测试化合物（在DMF中浓度为1.0×10^?3 M；每盘0.1 mL）的无菌滤纸圆盘（5 mm直径）。平板在28°C受控条件下孵育48小时以允许真菌生长和化合物扩散。通过测量圆盘周围抑制区直径（mm）确定抗真菌活性。使用商业抗真菌剂克霉唑作为阳性参考标准以评估测试真菌病原体的相对敏感性。

为评估H₂L及其金属配合物对正常人类细胞的细胞毒性，使用正常人前列腺上皮细胞系（PrEC）进行初步测定。PrEC细胞系从埃及VACSERA Inc.获得，并在Eagle最低必需培养基（EMEM；Bio-Whittaker-Lonza, Switzerland）中培养，补充有10%（v/v）胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素溶液（100 IU/mL）。细胞在标准培养条件下于37°C在含有5% CO₂和95%空气的湿润气氛中维持。在细胞毒性实验前常规进行传代以维持对数生长。

使用MTT比色法评估H₂L及其金属配合物的细胞毒性潜力。将PrEC细胞以5×10⁴ cells/mL的密度（每孔100 μL）接种在96孔板中，并允许过夜贴壁。初始孵育后，细胞暴露于测试化合物的系列稀释液（12.5, 25, 50, 100, and 200 μM）中48小时，在相同孵育条件下。处理后，更换培养液为含有MTT溶液（0.5 mg/mL）的100 μL新鲜培养基，平板再孵育4小时。活细胞将MTT还原为不溶性紫色甲臜晶体，随后通过加入150 μL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）的0.01 N HCl溶解。使用Biotek ELISA板阅读器（Gen5, USA）在570 nm测量每孔的吸光度。使用公式计算细胞活力。半数最大抑制浓度（IC₅₀）定义为抑制50%细胞活力所需的化合物浓度，对每种测试化合物进行测定。

结果与讨论

合成的Cr(III)、Mn(II)和Co(II)金属配合物产率高（76.85%–89.57%），在室温下稳定，溶于DMF、DMSO-d₆，并具有高熔点（279°C至290°C）。物理和分析数据总结显示，所有合成的配合物均呈现1:1的配体与金属离子摩尔比，并含有配位和/或晶格水分子。H₂L的摩尔电导率为10.23 Ω^?1 mol^?1 cm²，与其非电解质性质一致。相比之下，金属配合物显示出显著更高的电导值，范围从180.36到264.25 Ω^?1 mol^?1 cm²。这些值表明配合物（1）表现为1:3电解质，而配合物（2）和（3）为1:2电解质，与类似配位化合物的既定文献值一致。配合物外部氯离子的存在通过定性反应确认。硝酸银溶液与其配合物溶液反应生成白色氯化银沉淀，这与摩尔电导率测量结果一致。

红外光谱用于阐明H₂L配体与Cr(III)、Mn(II)和Co(II)离子的配位行为。H₂L的红外光谱在3353至3500 cm^?1之间观察到宽吸收带，可归因于配位水分子和H₂L羧酸的O─H伸缩振动。此外，在845和608 cm^?1附近出现的与配位水的摇摆和摇动振动相关的波段支持所有配合物中水的存在。哌嗪基团中季铵氮的ν(N─H)振动在2939–2460 cm^?1处，表明H₂L在其配位形式中具有两性离子性质。H₂L的红外光谱在1721和1630 cm^?1处显示两个波段，分别对应羧酸ν(COOH)和偶氮甲碱基团ν(─CH═N─)的伸缩振动。在所有配合物中1721 cm^?1处波段的消失，以及偶氮甲碱基团从1630到1524 cm^?1的蓝移表明羧酸基团的一个氧原子和偶氮甲碱基团的氮原子与金属离子配位形成六元环。ν_as(COO^?)在1612–1603 cm^?1区域和ν_s(COO^?)在1404–1390 cm^?1集合的出现，且Δν > 200 cm^?1，证明羧酸基团通过其中一个氧原子作为单齿连接在我们的配合物中。在763–512 cm^?1范围内，配合物光谱中出现的新波段与ν(M─O)和ν(M─N)伸缩振动相关，证实了偶氮甲碱氮和羧酸氧与金属中心的配位。

在二甲基亚砜中200–800 nm范围内获取了游离H₂L及其金属配合物的UV-Vis光谱，以更好地理解我们化合物的电子结构。H₂L的跃迁（π–π和n–π）发现在34482和31746 cm^?1。这些跃迁发生在具有酮或偶氮甲碱基团的不饱和烃中。配合物在22 222至20 408 cm^?1之间显示出独特的波段，可能源于配体-金属电荷转移（MLCT）。Cr(III)配合物的UV-Vis光谱显示两个吸收波段在18 867和17 211 cm^?1，描述了⁶A_2g→⁴T_2g (F)和⁴T_2g→⁴T_1g (F)跃迁。相应的表观磁矩值为3.82 B.M.暗示了八面体几何构型。Mn(II)配合物的电子光谱显示两个可识别波段在19 417和16 528 cm^?1，对应⁶A_1g→⁴T_1g (4G)和⁴A_1g→⁴E_g, ⁴A_1g (4G)跃迁，μ_eff值为1.80 B.M.，表明配合物的低自旋八面体结构。Co(II)配合物显示一个可识别波段在18 018 cm^?1，对应⁴T_1g (F)→⁴T_1g (P)跃迁，这与六配位Co(II)配合物的预期波段一致。配合物的摩尔吸光系数（ε）使用关系式A = ?Cl估算，其中A是吸光度，C = 1×10^?3 M，l是细胞长度（1 cm）。

建议的分子结构也通过¹H NMR光谱证实。在DMSO-d₆中记录了H₂L及其配合物的¹H NMR光谱。通过比较配合物的¹H NMR光谱与H₂L的光谱，对每个信号进行了归属。比较H₂L与其配合物的主要峰，观察到游离H₂L的所有信号都存在于所有配合物的¹H NMR光谱中，除了在δ 11.22 ppm处的信号，该信号对应羧酸基团的──OH，在所有配合物中消失。该信号的消失归因于H₂L通过羧酸基团螯合。三重峰信号在δ: 1.12–1.31 ppm归因于δ, ──CH₃脂肪族，单峰信号在δ: 1.91 ppm归因于δ, ──NH，多重峰在δ: 7.17–8.86 ppm为──CH芳香族，单峰信号在δ: 11.22 ppm对应羧酸基团的──OH。δ 11.22 ppm处的信号在所有配合物中消失，归因于H₂L通过羧酸基团与Cr(III)、Mn(II)和Co(II)配位。此外，配合物的¹H NMR光谱在4.33–4.45 ppm范围内显示新信号， due to the presence of water molecules in the complexes。

光学带隙（E_g）根据公式确定。其中hν是光子能量，h是普朗克常数，α是吸收系数，n对于允许的直接和间接电子跃迁分别等于1/2或2。图1展示了(αhν)²对(hν)的图和E_g通过延长曲线的线性部分直到(αhν)^1/2 = 0导出。(α)假设方程α = 1/d ln (1/T) (4)计算，其中d代表比色皿的光路长度，T代表估计的透射率。在DMF溶剂中，H₂L、Cr(III)、Mn(II)和Co(II)化合物在第一区域和第二区域的E_g分别为4.16、3.62、3.55和3.73 eV。数据显示配合物化降低了配合物的E_g值。E_g的降低是由电子向金属移动引起的。提出Cr(III)、Mn(II)和Co(II)通过在其壳层接受电子来增加配体电子的动员，从而扩大所得配合物中局域能级的宽度并降低E_g。这一发现在光学、电子学和能量转换设备中有多种应用。事实上，窄的E_g通过允许电子在HOMO和LUMO能级之间发生跃迁来增强分子的电导率。根据所述光学特性，生产的化合物可用作半导体，其范围与高效太阳能材料相同。具有光学带隙（E_g）3.55 eV的Mn(II)配合物适用于光学、电子学和能量转换设备。

质谱通过将碎片离子分组进行；这些随后按质荷比（m/z）倍增。化合物的质谱完成，证实了预期的分子式，这与元素分析和热重分析的数据一致。分子离子峰对于H₂L及其配合物（1）、（2）和（3）分别指定在m/z = 778 (43.28%)、1044 (28.12%)、1011 (35.67%)和1033 (43.56%)。分子离子峰[a]消除C₅H₁₀N₂以提供碎片[b]在m/z = 680 (24.96%)， also it loses C₁₀H₂₀N₄ to give fragment [c] at m/z = 582 (18.67%)。此外，它失去C₆H₁₁N₂O₂以提供碎片[d]在m/z = 635 (26.14%)，它排除C₁₂H₂₂N₄O₄, C₂₂H₂₂N₂O₄, CHO₂, and C₂H₂O₄导致碎片[e]在m/z = 492 (27.90%), [f]在m/z = 520 (29.30%), [g]在m/z = 733 (17.30%), and [h]在m/z = 688 (48.47%)。模型指定了配合物（2）的碎片化设计，离子峰[a]在m/z = 1011 (35.67%)消散Cl以生成[b]在m/z = 975 (42.31%)，然后它去除Cl₂以生成[c]在m/z = 940 (22.85%)。分子离子峰[a]消散Cl₂·H₂O用于[d]的形成在m/z = 922 (59.67%)， and Cl₂·2H₂O produces [e] at m/z = 904 (17.98%)。分子离子峰[a]消散Cl₂·3H₂O，产生碎片[f]在m/z = 886 (32.87%)。

H₂L和我们配合物（1）、（2）和（3）的TG和DTG研究进行。H₂L的TG分三个不同的阶段进行，预计质量消除96.80%（计算值96.93%）在三个最高温度225°C、322°C和625°C，可能归因于2H₂O、14C₂H₂和C₂H₂ + 3C₂N₂ + 4HF + SO₂ + N₂的损失。配合物（1）显示三个主要降解步骤。初始阶段在最高温度60°C发生，导致重量损失6.55%，对应于四个未配位水分子的 expulsion。第二阶段的恶化在T_max 296°C进行，重量损失32.26%（计算值32.37），对应13C₂H₂的损失。第三阶段的 breakdown 在两个最高点595°C和703°C发生，导致重量减少44.89%（计算值44.27），这对应于C₂H₂ + 2NH₃ + 4HF + 3HCl + 0.5H₂O + 2NO + C₂N₂ + SO₂ + N₂。这三个过程的实际重量损失为83.70%，这与最终产物含有0.5Cr₂O₃和8C的计算发现83.53%相似。TG配合物（2）和（3）分三个阶段分解，并表现出基本相似的热行为：第一个显示晶格水分子在T_max 114°C和106°C disintegration。第二分解步骤在T_max 314°C和306°C显示16C₂H₂ 40.94%（计算值41.11%）和14C₂H₂ 35.00%（计算值35.21%）的消除。第三步需要在598°C和573°C最高点分解显示损失2C_极H₂ + 4HF + 2HCl + 0.5H₂ + 2NO₂ + SO₂ + C₂N₂ + 2N₂ 46.56%（计算值46.34%）和4C₂H₂ + 2NH₃ + 4HF + 2HCl + 0.5H₂O + 2NO<>2 + SO₂ + C₂N₂ + 2N₂ 50.80%（计算值50.38%），分别留下Mn和Co作为残留物。配合物的稳定性不同，这取决于配体供体原子与金属离子之间键的强度以及分子间氢键的强度，这赋予了一个配合物相对于另一个配合物的不同稳定性。配合物2比其他配合物更稳定。

使用Coats–Redfern和Horowitz–Metzger方法研究了我们化合物的热分解相关的动力学热力学属性，包括活化能（E_a）、焓（ΔH）、熵（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG）。对于H₂L及其金属配合物，分解的E_a范围在Coats–Redfern模型中为12.89至90.06 kJ mol^?1，在Horowitz–Metzger模型中为15.10–57.45 kJ mol^?1。高（E_a）值说明了配合物的热稳定性。增加的ΔG值意味着后续配体将比后续配体更逐渐地被去除，导致TΔS从一个阶段到下一个阶段增加。这可能归因于在 expulsion 一个或多个配体后剩余配合物的结构刚性，与先前的配合物相比，需要更多的能量，TΔS，用于其重组 before experiencing any change。所有配合物中ΔS的负值表明了它们的稳定性。ΔH的正值表明吸热分解过程。

合成的H₂L及其金属配合物的抗菌潜力针对四种病原细菌菌株——蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性），以及大肠杆菌和铜绿假单胞菌（革兰氏阴性）——以及两种真菌物种，白色念珠菌和青霉进行评估。抗菌效果以标准参考抗生素为基准：环丙沙星和阿米卡星