整合分析揭示自噬调控动脉粥样硬化发展的六个关键基因及其免疫微环境机制

本文通过整合GEO数据库中动脉粥样硬化斑块数据集，结合差异表达基因（DEGs）分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和多种机器学习算法（包括LASSO、随机森林、XGBoost），筛选出13个自噬相关重叠基因，最终鉴定出HSPB8、MYOCD、TLR7、HMOX1、RYR2、NCF1和TBC1D10C等7个枢纽基因。研究构建了诊断模型（AUC=0.833），并通过RT-PCR在泡沫细胞模型中验证基因表达。免疫浸润分析显示斑块组免疫活性显著增强，同时构建了TF-miRNA-mRNA调控网络，为动脉粥样硬化（AS）的机制研究和靶点治疗提供了新方向。

　　

1. 引言

动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是一种以慢性炎症为特征的疾病，是心血管疾病的主要诱因。其发病机制涉及糖脂代谢紊乱、内皮损伤和炎症反应等多种调控因素的相互作用。自噬（Autophagy）作为关键细胞机制，通过代谢细胞内成分和更新特定细胞器维持稳态，在AS发展中发挥重要作用。自噬相关基因（ARGs）的表达异常与AS密切相关，例如ULK1缺失会损害自噬并抑制血管平滑肌细胞（VSMC）迁移，而BECN1表达减少则减弱内皮细胞自噬保护作用。本研究通过整合GEO数据库中的AS斑块数据集（GSE43292和GSE100927），结合生物信息学方法，旨在分析AS斑块中差异表达的自噬相关基因（DEARGs），并利用机器学习鉴定枢纽基因，最终通过体外实验验证这些基因在AS中的表达。

2. 材料与方法

2.1. 数据获取与预处理

从GEO数据库获取GSE43292（32例AS斑块和32例正常组织）和GSE100927（72例AS斑块和35例正常动脉组织）数据集，合并后使用SVA包去除批次效应。GSE57691作为验证集。从人类自噬调控数据库（http://hamdb.scbdd.com）获取794个ARGs。

2.2. 差异表达基因（DEGs）筛选

使用limma包分析合并数据集，筛选条件为调整后p值<0.05且倍数变化（FC）>2，共获得259个DEGs（62个下调，197个上调）。

2.3. 功能富集分析

通过clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示DEGs显著富集于免疫相关通路（如T细胞活化、白细胞迁移），KEGG分析显示富集于结核病、吞噬体和趋化因子信号通路。

2.4. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

使用WGCNA包构建共表达网络，软阈值设为8（尺度自由R²=0.86），最终识别22个共表达模块。选取与AS相关性最高的模块（turquoise、midnight blue、orange和salmon），提取1400个基因。

2.5. 样本聚类

基于13个重叠基因的表达矩阵，使用ConsensusClusterPlus包进行共识聚类，最佳聚类数k=2，分为C1和C2两组。

2.6. 机器学习算法筛选关键基因

采用随机森林、XGBoost、LASSO和岭回归四种算法筛选关键基因。随机森林基于基尼系数和准确性排名前9基因，LASSO识别10个基因，岭回归识别13个基因，XGBoost选取重要性最高的9个变量。最终交叉获得7个枢纽基因：HSPB8、MYOCD、TLR7、HMOX1、RYR2、NCF1和TBC1D10C。

2.7. 预测模型构建

使用pROC包绘制ROC曲线，AUC>0.6的基因作为诊断标志物。基于6个基因（TLR7除外）构建逻辑回归模型，准确率73.68%，AUC=0.833。

2.8. 免疫浸润分析

使用CIBERSORT算法分析22种免疫细胞在AS和正常样本中的浸润差异。AS组显示记忆B细胞、调节性T细胞、CD8⁺ T细胞、γδ T细胞、M0巨噬细胞和活化肥大细胞增多，而 na?ve B细胞、浆细胞等减少。

2.9. TF-miRNA-mRNA调控网络构建

通过hTFtarget数据库识别枢纽基因的转录因子（TFs），starBase数据库预测调控miRNA，构建调控网络（含56对互作关系和253个TFs）。

2.10. 泡沫细胞模型验证

THP-1细胞经PMA分化为巨噬细胞，再用ox-LDL处理形成泡沫细胞。通过RT-PCR检测枢纽基因mRNA表达。

2.11. 逆转录定量PCR（RT-PCR）

使用TRIzol试剂提取RNA，合成cDNA后通过qPCR分析基因表达，采用2^?ΔΔCt方法定量。

3. 结果

3.1. 数据处理与DEG筛选

PCA显示合并数据集批次效应被有效去除（图2a,b）。火山图展示259个DEGs（图2c）。

3.2. GO与KEGG富集分析

GO分析显示DEGs富集于免疫细胞活化、迁移和信号转导等功能（图3a）；KEGG分析显示富集于结核病、吞噬体等通路（图3b）。

3.3. WGCNA分析与枢纽基因筛选

WGCNA识别22个模块，模块-性状分析显示特定模块与AS高度相关（图4d）。Venn图交叉获得13个重叠基因（图4e）。

3.4. 机器学习筛选关键基因

四种算法交叉验证获得7个枢纽基因（图5h），其中HSPB8的AUC最高（0.912）。

3.5. 自噬-AS预测模型构建

训练集中7个基因AUC均>0.6，验证集中6个基因（除TLR7）AUC>0.6。逻辑回归模型准确率73.68%，AUC=0.833（图6c,d）。

3.6. 关键基因相关聚类分析

共识聚类将AS样本分为C1和C2两组，PCA显示显著差异（图7d）。C1组HMOX1、NCF1等表达升高，C2组RYR2、HSPB8等表达升高（图7e）。免疫浸润显示C1组富集活化记忆T细胞、M0巨噬细胞，C2组富集浆细胞、CD8⁺ T细胞等（图7f）。

3.7. 免疫浸润分析

AS组免疫细胞浸润显著，记忆B细胞、调节性T细胞等增多， na?ve B细胞等减少（图7g）。

3.8. TF-miRNA-mRNA调控网络

构建包含枢纽基因、miRNA和TFs的调控网络（图7h），揭示基因调控的复杂层次。

3.9. 泡沫细胞中枢纽基因表达验证

RT-PCR显示HSPB8、MYOCD、RYR2、HMOX1、TBC1D10C和NCF1在泡沫细胞中表达符合预期（图8a-f）。

4. 讨论

本研究通过整合生物信息学分析和实验验证，鉴定出6个通过自调控影响AS的关键基因（HSPB8、MYOCD、HMOX1、RYR2、NCF1、TBC1D10C）。这些基因在免疫浸润和自噬调控中发挥核心作用：

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  TBC1D10C通过抑制T细胞信号通路和自噬促进AS；

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  HMOX1通过抗氧化和诱导自噬发挥保护作用；

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  NCF1通过NADPH oxidase产生活性氧（ROS）影响自噬流；

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  HSPB8参与错误折叠蛋白的自噬识别；

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  RYR2通过钙信号调控自噬；

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  MYOCD通过抑制自噬（ via miR-30a转录）加剧AS。

  免疫浸润分析证实AS斑块中免疫活性增强，枢纽基因与M0巨噬细胞密切相关。预测模型显示高诊断价值（AUC=0.833），实验验证进一步支持其可靠性。这些基因可作为AS诊断生物标志物和治疗靶点。

5. 结论

本研究鉴定出6个通过自噬调控AS进展的关键基因（HSPB8、MYOCD、HMOX1、RYR2、NCF1、TBC1D10C），并验证其诊断潜力。结果为AS的机制研究和靶向治疗提供了新视角。