历史地衣标本的首个全基因组测序实现真菌与藻类共生体的全基因组分析

本研究首次建立了对历史地衣标本进行全基因组测序的有效方法，成功从72年历史的标本中获取了真菌共生体（mycobiont）和藻类共生体（photobiont）的全基因组数据，为博物馆珍藏标本的基因组学研究开辟了新途径，解决了地衣学中因DNA高度降解而长期存在的实验难题。

　　

引言

自然历史博物馆和植物标本馆中的生物标本为理解自然界提供了宝贵资源。随着高通量测序技术的发展，这些历史标本成为遗传研究的新前沿。历史DNA（从单个基因到完整基因组）不仅为传统分类和系统发育研究提供了关键证据，还在进化、群体遗传学、保护及生物多样性研究中展现出巨大潜力。然而，由于历史标本中DNA随时间逐渐降解，其应用仍局限于特定生物类群。

地衣作为真菌和藻类（或蓝细菌）的共生体，其历史标本的DNA研究面临特殊挑战。DNA片段大多短于50 bp，且地衣中含有可能干扰DNA提取和PCR扩增的特殊物质。因此，尽管遗传信息在地衣学中的重要性日益增加，但此前仅少数研究成功从历史地衣标本中测序了几个短遗传标记，全基因组测序尚未见报道。本研究旨在建立一种高效方法，实现对历史地衣标本的全基因组测序，从而将珍藏标本转化为全基因组研究的资源。

材料与方法

样本信息

本研究使用了两种地衣标本：Usnea hakonensis（标本编号UhA TNS-L 21776A和UhiL TNS-L 119447，后者为lectotype）和Cladonia kurokawae（CkuR TNS-L 27578，holotype）及C. subconistea（Csu1 TNS-L 27557，lectotype）。所有标本均收藏于日本国立科学博物馆（TNS），存储条件为22°C和40%湿度，标本馆每年进行一次熏蒸（早期使用甲基溴，后期改用硫酰氟）。

全基因组测序与参考基因组

为获得参考基因组，本研究对Cladonia kurokawae的独立培养真菌共生体和藻类共生体进行了全基因组测序。使用DNeasy Plant Mini kit提取DNA，构建Illumina文库，并在Novaseq X平台上进行150 bp双端测序。使用CLC Genomic Workbench进行de novo组装，并通过gVolante评估基因组完整性。

DNA提取方案的优化

DNA提取与缓冲液交换

针对历史标本DNA高度降解的特点，本研究优化了DNA提取流程。使用DNeasy Blood & Tissue Kit，在裂解步骤中通过多次更换裂解缓冲液去除样本表面的非目标生物（主要是细菌）DNA。具体而言，在37°C孵育过程中，分别于1小时、5小时和24小时收集上清液，以考察缓冲液交换对提高目标DNA比例的效果。

DNA纯化与文库构建

DNA提取后，使用Amicon Ultra Centrifugal Filters和MinElute PCR Purification Kit进行纯化。构建文库时采用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit，并调整了AMPure XP beads的用量以富集短DNA片段。为减少PCR扩增过程中片段复杂性的降低，每个标本构建了三个独立的DNA文库，最终合并进行测序。

测序数据比对与分析

原始读段经修剪后，使用CLC Genomics Workbench比对到参考基因组（Usnea hakonensis和Cladonia kurokawae的真菌和藻类基因组）。通过计算比对读段的平均长度、覆盖度等指标评估数据质量。使用mapDamage评估DNA损伤模式，并通过GATK和PhyML进行单核苷酸变异（SNV） calling和系统发育分析。

结果

DNA提取方案的优化效果

通过优化DNA提取流程，成功从4 mg标本中获取足够DNA进行文库构建。测序数据显示，修剪后读段中源自真菌共生体和藻类共生体的比例分别为2.68%–23.31%和3.00%–11.82%，平均读段长度短于46 bp，覆盖了73%–99%的真菌基因组和92%–99%的藻类基因组。缓冲液交换实验表明，孵育1小时后更换缓冲液可有效去除非目标DNA，提高目标DNA比例。

系统发育分析

基于792,245个SNV位点构建的系统发育树显示，两个Usnea hakonensis标本与参考基因组聚为一支，自展支持率为95%。类似地，Cladonia标本的410,705个SNV位点分析也确认了其系统发育位置，holotype标本与独立培养的参考样本聚类一致（自展支持率100%）。

方法适用性验证

本研究方法成功应用于不同种类和年龄的地衣标本，包括72年历史的Cladonia标本。测序数据覆盖了97%–99%的真菌基因组和98%–99%的藻类基因组，平均覆盖深度达14.73×–424.67×，表明该方法对多样本类型具有广泛适用性。

讨论

方法优势与局限性

本研究首次实现了历史地衣标本的全基因组测序，解决了因DNA高度降解而长期存在的技术难题。该方法仅需少量标本材料（4 mg），且通过优化DNA提取流程有效提高了目标DNA比例。然而，该方法仍受标本可用性和测序成本限制，且依赖参考基因组进行数据比对。

DNA保存与损伤模式

研究发现，地衣标本中DNA碎片化程度高，平均读段长度短于50 bp，与古代DNA特征一致。有趣的是，藻类DNA保存状态优于真菌DNA，可能与生物量差异有关。此外，典型古代DNA损伤模式（如C>T置换）在本研究标本中未显著出现，可能因其年龄相对较轻。

未来应用前景

本研究建立的方法为利用博物馆珍藏地衣标本进行全基因组研究提供了可行方案。通过优化实验流程和降低测序成本，该方法有望应用于更广泛的地衣类群和年代样本，推动地衣学在分类、进化及保护生物学中的发展。

作者贡献与资助

研究由Mieko Kono、Yoshihito Ohmura和Yohey Terai共同完成，得到了JSPS KAKENHI的资助（项目号JP21H02547、JP22K15172和JP24K09599）。作者声明无利益冲突。