河口环境中阿米巴与细菌丰度的时空动态及其环境驱动机制研究

本综述系统探讨了自由生活阿米巴（FLA）与细菌在河口环境中的时空分布规律，揭示了盐度（salinity）和溶解氧（DO）作为关键环境参数对微生物群落结构的影响，强调了气候变化背景下河口生态系统微生物互作（如Naegleria-Vibrio正相关）对病原演化的潜在意义。

　　

1 引言

自由生活阿米巴（FLA）是一类广泛分布于自然环境的吞噬性原生生物，属于Amoebozoa、Heterolobosea和Rhizaria等主要真核生物谱系，可栖息于土壤、海水和淡水环境。海洋环境中的FLA研究相对匮乏，但淡水常见属如Acanthamoeba、Vermamoeba和Naegleria在海洋中亦有发现。早期研究已证实海水环境中存在Acanthamoeba、Vannella和Vexillifera等属的定殖，尽管海洋FLA多样性尚未被充分探索，理论上所有阿米巴类群均可能存在于海洋环境。例如，Vampyrellida目FLA（Endomyxa, Rhizaria）可通过捕食活动显著调控藻类和硅藻水华。近年来，Paramoeba和Neoparamoeba（Dactylopodida, Amoebozoa）因引致养殖鲑鱼阿米巴鳃病（AGD）而受到关注，该病对海洋养殖业具有重大经济影响。

FLA作为吞噬微生物，主要以细菌为食，其在环境中调控微生物种群的作用已被广泛认可。这种捕食压力可能促使细菌演化出吞噬抗性并增强致病性。例如，抵抗FLA的细菌往往对人类或动物巨噬细胞也具有抗性，支持了“偶然进化假说”（virulence作为抗捕食机制的副产品）。因此，FLA被认为是促进新病原细菌出现和进化的重要驱动力。

常见抗阿米巴细菌包括Legionella（淡水与海水）、Vibrio（水生环境病原体如霍乱弧菌）、Mycobacterium（鱼类分枝杆菌病病原）和Pseudomonas（广泛分布于水环境）。环境参数的变化（如气候变化）可能显著影响微生物分布与致病性，例如升温可能促进嗜热性病原Naegleria fowleri增殖，而降雨与湿度增加与Legionella pneumophila病例上升相关。河口和沿海水域作为受淡水输入、盐度变化和温度波动影响显著的退化生态系统，尤其易受环境压力影响，导致生物多样性丧失和水质恶化（如富营养化与污染）。

本研究通过为期1年的时空采样（从河流到河口），监测了环境参数（温度、盐度、溶解氧和降水）的变化，并采用qPCR技术分析了特定FLA属、细菌属及病原种的丰度，进一步探讨了环境参数与微生物间的相关性。

2 材料与方法

2.1 采样点与环境参数

研究区域覆盖法国夏朗德河河口至大西洋沿岸的5个站点，沿盐度梯度设置：站点1（海洋环境）、站点2（沿海）、站点3-5（河口至上游淡水）。使用多参数探头测量温度、盐度和溶解氧，降水数据来自气象站。每月采集水样（2 L），过滤后于-20°C保存直至DNA提取。

2.2 引物设计

针对Naegleria、Vermamoeba、Vannella和Paramoeba属的18S rRNA序列设计新引物，通过BLAST和PR2数据库验证覆盖度与特异性（覆盖率90%-100%）。另采用文献已发表引物检测Acanthamoeba、Vibrio、Pseudomonas、Legionella和Mycobacterium属及特定病原种（如V. cholerae ompW基因）。所有引物均通过标准曲线验证qPCR效率。

2.3 环境DNA提取

使用DNEasy PowerWater试剂盒从0.45 μm滤膜提取总DNA，QIAcube自动化仪器操作，最终洗脱体积50 μL。

2.4 定量PCR

采用LightCycler 480 II平台，SYBR Green或TaqMan探针法进行qPCR。循环条件包括预变性、退火（温度依引物而定）和延伸步骤，并通过熔解曲线或荧光采集确保特异性。

2.5 统计分析

使用vegan包进行非度量多维尺度分析（NMDS），基于Bray-Curtis相异指数评估样本分布与环境因子的关系（显著性p<0.05）。采用Spearman秩相关分析（corrplot包）探究微生物丰度与环境参数的相关性。

3 结果

3.1 环境特征

盐度显示沿海站点（1-2）与河口站点（3-5）明显分离，站点2在2023年11月盐度从34骤降至19.3 psu，站点3盐度变幅最大（0.3-24.5 psu）。温度趋势一致，但河口站点冬冷夏暖更显著。溶解氧在河口站点波动剧烈（站点3：4.1-12 mg/L），沿海站点较稳定。降水数据表明2023年1月、2月和6月无降雨，最高降水量出现在2023年11月（站点2达27.5 mm）。

3.2 FLA引物特异性

新设计引物显示高属特异性（100%）和覆盖度（90%-100%），仅Vannella引物与Urocystis（担子菌门）有交叉。

3.3 微生物丰度时空变化

FLA中Naegleria检出率最高（90%），遍布所有站点，春夏季丰度上升；Acanthamoeba（80%）和Vermamoeba（65%）多见于站点1和5；Paramoeba（43.33%）和Vannella（16.67%）检出率低。细菌中Vibrio（90%）和Pseudomonas（76.67%）最常检出，Vibrio在站点1丰度最高（1.62×10⁸ copies/L）；Legionella主要于站点5（淡水）检出；Mycobacterium罕见；病原种仅L. pneumophila在2个样本中检出（低于定量限）。

3.4 环境参数影响

NMDS显示盐度和站点位置显著影响FLA群落结构（p≤0.001），样本按站点聚类；盐度与溶解氧是细菌群落的主要驱动因子（p<0.05），二者呈负相关。Spearman分析揭示盐度与溶解氧（r=-0.71）、Legionella（r=-0.62）、Naegleria（r=-0.42）和Paramoeba（r=-0.39）呈负相关；溶解氧与Legionella正相关（r=0.65）。FLA与细菌间存在强正相关：Acanthamoeba与Vibrio（r=0.65）、Pseudomonas（r=0.57）；Naegleria与Vibrio（r=0.60）、Pseudomonas（r=0.68）、Legionella（r=0.62）；Paramoeba与Pseudomonas（r=0.46）、Legionella（r=0.43）。Vermamoeba和Vannella无显著关联。

4 讨论

盐度作为关键环境因子，显著塑造了微生物群落结构。本研究首次通过qPCR沿盐度梯度量化FLA丰度，新引物兼具高特异性与覆盖度。Naegleria为最优势属（全年检出），其广盐性（halotolerance）拓展了该属已知生态位（传统认为淡水分布）。Acanthamoeba与Vermamoeba的季节动态差异反映其生态适应性，而Paramoeba和Vannella的低检出可能受方法灵敏度限制。

细菌中Vibrio（海洋偏好）和Pseudomonas的普遍存在符合其生态特征，Legionella于淡水站点的检出与文献一致（但可通过FLA关联于海洋环境），Mycobacterium的稀少可能因其偏好生物膜栖息。环境参数分析证实盐度与溶解氧的拮抗作用（溶解度随盐度上升而下降），并直接调控微生物丰度——盐度升高可能触发FLA成囊（osmotic stress响应），溶解氧下降影响好氧细菌群落。

FLA与细菌的强正相关（如Naegleria与Vibrio/Pseudomonas/Legionella）可能反映特异性捕食关系或互利共生，暗示FLA作为“病原进化熔炉”的生态功能。Vermamoeba和Vannella的弱关联则表明属间相互作用差异。

5 结论

本研究阐明河口环境中FLA（以Naegleria为主）和细菌（以Vibrio为主）的时空分布模式，验证盐度与溶解氧为核心环境驱动因子。新开发qPCR引物为FLA监测提供可靠工具。气候变迁可能通过改变这些参数影响微生物群落动态与病原演化，需持续关注河口生态系统的微生物互作与健康风险。

作者贡献与致谢

Ga?lle Bednarek负责数据采集与分析，Hélène Agogué、Vincent Delafont和Yann Héchard主导概念设计与方法优化，Arno Bringer与Tony Agion提供资源与资金支持。研究受新阿基坦大区资助，感谢SOMLIT、REPHY及QUALYSE团队提供采样与数据支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。