魁北克森林苗圃疫霉爆发：新树病病原体 Phytophthora abietivora 的浮现及其潜在威胁

本研究报告了加拿大魁北克圣莫德斯特公共苗圃中由 Phytophthora abietivora（P. abietivora）引起的香脂冷杉（Abies balsamea）幼苗大规模死亡事件。研究通过病原分离、分子检测（qPCR）和致病性实验，首次证实该疫霉在苗圃条件下的爆发，并发现其可潜伏于无症状幼苗（包括云杉等多种树种），通过土壤传播至易感宿主。人工淹水条件加剧疾病发展。研究强调苗圃在病原传播中的关键作用，呼吁加强检测与管理以保护森林及圣诞树产业，对植物检疫和森林健康具有重要警示意义。

　　

1 引言

树苗圃在加拿大经济和重新造林努力中扮演关键角色，每年生产超过6亿株幼苗。尽管管理措施严格，苗圃仍无法完全避免病原体爆发，这可能带来毁灭性影响。2022年10月，魁北克圣莫德斯特公共苗圃发现其2年生香脂冷杉（Abies balsamea）幼苗死亡率异常升高。近期被识别为圣诞树种植园中疫霉根腐病（PRR）原因的 Phytophthora abietivora 被怀疑是此次爆发的病原体。本研究旨在识别苗圃中爆发的病原体，确定其致病性及向其他幼苗的传播能力。

2 材料与方法

2.1 苗圃及其栽培实践描述

圣莫德斯特苗圃位于加拿大魁北克Bas-St-Laurent行政区，由魁北克自然资源和森林部管理，每年生产4至6百万株针叶树幼苗用于重新造林。所有幼苗均在排水良好的高床上用塑料容器培育，使用来自附近池塘的非处理、非过滤水进行顶灌。

2.2 污染苗床的香脂冷杉幼苗采样

疫霉根腐病爆发发生在两个相邻的苗床，涉及50万株2年生香脂冷杉幼苗。2022年10月，从这两个受感染苗床任意采集了214株幼苗，分为健康（122株）、有症状（45株）和死亡（47株）三类。

2.3 其他针叶树物种采样

2023年春季，对苗圃中所有其他针叶树物种进行了系统采样，采用分层系统采样方案，按幼苗批次分层，采样数量与总幼苗数成比例。

2.4 病原体分离

从每株冷杉幼苗的根段和根颈芯片取样，清洗并表面灭菌后，铺在澄清V-8 PARPNH琼脂培养基上，在20°C黑暗培养。菌落出现后，转移菌丝尖端至澄清V-8琼脂培养基获得纯培养。

2.5 P. abietivora 对冷杉和云杉幼苗的致病性

使用两个 P. abietivora 分离株（CFL5994来自本苗圃，CFL5980来自康涅狄格）和一个 P. europaea 分离株（CFL5991来自瑞士）进行致病性测试。接种体制备采用V8汁琼脂培养，将菌丝块接种到无菌蛭石、燕麦和V8蔬菜汁混合物中培养2周。病原性测试在弗雷泽冷杉和白云杉幼苗上进行，采用1升塑料容器，填充灭菌盆栽土 mix。幼苗在温室条件下培养，直至芽破裂后，添加接种的盆栽土 mix。部分幼苗接受间歇淹水处理（每2周淹水48小时），部分不淹水。每周监测根腐病症状，记录受影响组织百分比。

2.6 无症状幼苗疾病发展及向易感受体幼苗的传播性

传播研究中，树木成对种植，每对包括一个供体（2年生香脂冷杉）和一个受体（4年生弗雷泽冷杉）。供体和受体盆栽在相距10厘米的1.5升塑料容器中，使用相同盆栽土 mix，在相同温室条件下维持。部分盆栽接受间歇淹水，部分不淹水。每株幼苗按病原性实验方式监测。

2.7 DNA样品制备及土壤和根样本的DNA提取

从每株冷杉幼苗及其他针叶树物种的根插和根颈取样，清洗后放入PowerBeads管中，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit进行DNA提取。病原性实验结束后，对每株幼苗的根系取样。传播实验中，还对盆栽土 mix 取样，均质化后取250毫克转移至PowerBeads管进行DNA提取。

2.8 使用P_abi_detect qPCR assay进行检测

使用 P. abietivora 检测 assay（P_abi_detect）对样本进行检测，每个10μL qPCR反应 mix 包含1× SensiFAST Probe No-ROX mix、500 nM引物、100 nM探针和1μL DNA样本。循环条件为95°C 5分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 45秒。所有样本重复测试三次（其他针叶树样本重复两次），平均C_q值低于35.7视为阳性。

2.9 疫霉菌培养物的分子筛选

通过P_abi_detect qPCR assay对粗提DNA确认分离株身份。对qPCR阴性结果的分离株，随机选择25个进行确认，使用NADH脱氢酶亚基1（Nad^h1）基因引物进行PCR和测序。对qPCR阳性结果的其他针叶树样本，也使用Nad^h1 PCR在感染树木根提取的DNA上进行确认。

2.10 统计分析

所有统计分析在R v4.1.3中进行，使用生存曲线和log-rank检验，Beanplots绘制，Phi系数计算，疾病进展曲线下面积（AUDPC）计算。统计显著性阈值（α）设为0.05，p值经错误发现率方法校正。

3 结果

3.1 确认苗圃爆发病原体为 P. abietivora

从134个根和根颈样本中获得71个分离株，其中32个（45.1%）经qPCR确认为 P. abietivora。对29个Nad^h1序列测序，28个（96.5%）与 P. abietivora 匹配。死亡幼苗组分离率最高（66%），有症状组和健康组分别为55.6%和35.7%。分子检测显示，214个DNA样本中207个（96.7%） P. abietivora 阳性，死亡幼苗100%阳性，有症状和健康幼苗分别为97.7%和95.1%。平均C_q值在健康、有症状和死亡幼苗间无显著差异。qPCR检测还发现苗圃中其他针叶树物种（7/9种）无症状幼苗中 P. abietivora DNA阳性，阳性率0%至37.5%。

3.2 仅 P. abietivora 感染人工接种盆栽土中的弗雷泽冷杉幼苗

致病性 assay 显示，非接种对照和 P. europaea 接种土壤中的所有幼苗存活，PRR症状 minimal。在 P. abietivora 接种土壤中，首株幼苗死亡发生在接种后31天。苗圃分离株（CFL5994）在间歇淹水条件下导致100%幼苗死亡，无淹水条件下80%死亡。类型菌株（CFL5980）在间歇淹水条件下60%死亡，无淹水条件下无死亡。生存概率在淹水和无淹水条件下均有显著差异。AUDPC值分析显示，仅CFL5980菌株在淹水和无淹水条件下有显著差异。白云杉幼苗在接种CFL5994后无死亡或PRR样症状。

3.3 P. abietivora 从无症状供体幼苗传播

传播 assay 显示，幼苗死亡率在移植后17天即可观察到。供体幼苗（香脂冷杉）死亡率低（23.3%），而受体幼苗（弗雷泽冷杉）死亡率高（76.7%）。生存概率有显著差异， pairwise 比较显示差异存在于供体和受体之间， regardless of flooding。间歇淹水导致受体生存概率显著差异。AUDPC值表明，无淹水条件下供体和受体间差异显著，有淹水条件下不显著。

3.4 传播后，在供体和受体的土壤和根中检测到 P. abietivora

使用Pabi_detect assay对每个盆栽的盆栽土 mix 和供体、受体根样本进行检测。60个盆栽土样本中31个（51.7%） P. abietivora 阳性，平均C_q值32。供体根中78.3%检测到（平均C_q27.2），受体根中85%检测到（平均C_q24.0）。逻辑回归模型显示，供体或受体根中阳性检测并未显著增加土壤样本阳性检测几率。使用宽松阳性标准后，供体根中阳性检测显著增加土壤阳性几率。

4 讨论

苗圃中根腐病爆发的规模导致加拿大食品检验局建议在2023年春季销毁所有香脂冷杉生产。病原体分离和分子确认表明，大多数分离株为 P. abietivora，这是首次报道苗圃条件下由该病原体引起的大规模爆发。致病性测试证实 P. abietivora 对弗雷泽冷杉高度 aggressive，而 P. europaea 未引起疾病。qPCR检测显示，几乎所有有症状和死亡幼苗携带病原体，95%无症状幼苗也检测阳性，表明视觉检查严重低估感染数量。传播实验证明，病原体可从无症状供体传播至易感受体，导致疾病发展和死亡。苗圃中其他针叶树物种也检测到 P. abietivora DNA，提示这些物种可能作为病原体储存库或传播载体。研究强调苗圃在病原传播中的关键作用，呼吁加强检测和管理措施，以防止病原体扩散至自然生态系统。