Capicua蛋白调控出生后晚期海马苔藓纤维-CA3轴突靶向的精细化机制研究

本研究发现神经发育障碍相关蛋白Capicua（CIC）在小鼠海马发育中扮演关键角色。通过条件性基因敲除技术证实，CIC缺失导致苔藓纤维（MF）在出生后第二周出现持续性轴突靶向异常，单细胞转录组分析揭示颗粒神经元成熟过程中轴突导向基因（如Robo1、Ephb1、Dcc、Nrp1）的异常调控。该研究为理解海马神经环路的层特异性连接机制提供了新视角，对CIC相关神经发育障碍（如学习障碍、癫痫）的病理机制具有重要启示。

　　

1 引言

大脑神经环路的精确组装依赖于轴突投射对特定靶神经元亚细胞区域的精准定位。海马苔藓纤维（MF）-CA3通路是研究层特异性连接的经典模型，其投射在啮齿类动物出生后逐渐发育，并在第二周末形成成熟构型。MF轴突选择性地与CA3锥体神经元的近端树突段形成突触，却巧妙避开其胞体所在的 stratum pyramidale（SP）层。值得注意的是，齿状回颗粒神经元在出生后及成年期持续生成，这些新生神经元如何实现层特异性靶向的机制尚不明确。

近年来，神经发育障碍相关基因的研究为揭示脑发育新机制提供了独特视角。其中，转录抑制因子capicua（CIC）的杂合性功能缺失变异会导致CIC相关神经发育障碍（MIM #617600），表现为学习障碍、注意力缺陷多动障碍（ADHD）、自闭症和癫痫等神经行为表型。虽然小鼠研究表明CIC在神经元分化和树突发育中发挥重要作用，但其在轴突导向、细胞粘附或突触发生等方面的功能仍属未知。

2 材料与方法

本研究使用Emx1-Cre、Rbp4-Cre和Grik4-Cre等多种转基因小鼠品系，通过与Cic^flox/flox小鼠杂交获得条件性基因敲除模型。采用免疫荧光染色、免疫印迹、单细胞核RNA测序（snRNA-seq）等技术进行分子和细胞水平分析。通过腺相关病毒（AAV）介导的基因操作和新生鼠脑室内注射实现细胞特异性基因敲除。图像采集使用Leica SP8和Zeiss LSM 700共聚焦显微镜系统，数据分析采用Seurat和Monocle3等生物信息学工具。

3 结果

3.1 CIC缺失导致苔藓纤维异常投射至CA3 stratum pyramidale区域

研究发现CIC在出生后第5天（P5）的海马区广泛表达，在齿状回中主要集中于颗粒层外侧的成熟颗粒神经元。通过calretinin标记发现，CIC在calretinin阴性的成熟颗粒神经元中高表达，而在calretinin阳性的未成熟神经元中表达微弱。利用Emx1-Cre; Cic^flox/flox小鼠模型，发现在P20时突变小鼠出现显著的MF靶向异常：虽然suprapyramidal束仍投射至stratum lucidum（SL），但大量CALB1⁺ MF终端异常侵入SP区域。这些异常终端共表达锌转运蛋白ZnT3、突触前标记物synaptophysin和轴突标记物Tau，且终端数量和尺寸均显著增加。

时间进程分析显示，这种异常投射在P11时尚未出现，到P14时开始显现，P20时变得显著，并在11周龄时达到高峰，持续至1年龄。表明CIC缺失导致的MF靶向缺陷发生在出生后第二周，并持续至成年期。

3.2 CIC在齿状回颗粒神经元中促进层特异性苔藓纤维支配

为确定CIC作用的细胞类型特异性，研究使用Rbp4-Cre驱动子特异性敲除颗粒神经元中的CIC。发现在Rbp4-Cre; Cic^flox/flox; tdT小鼠中，尽管只有部分颗粒神经元发生CIC缺失（92.1% ± 7.2%），但同样出现tdT⁺ MF投射异常延伸至SP区域的现象，这些异常终端共表达CALB1和synaptophysin，并在8周龄时持续存在。表明颗粒神经元中CIC的缺失足以诱导持续性异位MF支配。

3.3 CA3神经元中CIC缺失不影响苔藓纤维投射

通过Grik4-Cre驱动子和AAV介导的镶嵌基因敲除技术，研究发现CA3神经元中CIC的部分缺失并不影响MF的层特异性靶向。在AAV8/Cre感染的Cic^flox/flox小鼠中，虽然CA3神经元中CIC被有效删除，但野生型MF并未异常支配CIC缺失的CA3神经元胞体。表明CIC在CA3神经元中对维持MF精确靶向并非必需。

3.4 Emx1-Cre; Cic^flox/flox敲除小鼠颗粒神经元成熟过程中轴突导向基因的失调

通过snRNA-seq对P19小鼠海马组织进行分析，发现颗粒神经元可分为7个亚群，包括3个未成熟（imGN1-3）和4个成熟（mGN1-4）亚群。基因本体分析显示，未成熟群富集转录相关术语，而成熟群富集突触传递相关术语。值得注意的是，敲除小鼠中表达Ntng1（netrin G1）和Itgav（integrin alpha-V）的mGN4亚群显著减少。

差异表达基因分析发现，所有群中"轴突发生"是最富集的GO术语。伪时间分析显示，在CIC缺失情况下，本应在未成熟神经元中高表达而在成熟过程中下调的"on-off"基因（包括Robo1、Ephb1、Dcc、Nrp1等轴突导向受体）出现表达动力学紊乱，这些基因在成熟阶段仍保持高表达。免疫染色证实NRP1异常定位于突变小鼠CA3 SP区的异位MF终端。

此外，研究发现CA3锥体神经元中Slit2（ROBO1配体）表达下调，而Sema3e（NRP1配体）表达上调。细胞间通讯分析表明，突变小鼠中CA3神经元与成熟颗粒神经元的相互作用增强，与未成熟颗粒神经元的相互作用减弱。

4 讨论

本研究揭示了CIC在出生后晚期海马发育中的新功能。与早期发育中semaphorin/plexin介导的排斥作用不同，C依赖的机制在出生后第二周开始精细化MF靶向，这一时间点与颗粒神经元的持续神经发生过程相吻合。CIC在成熟颗粒神经元中的上调表达可能促进了从轴突发生程序向神经传递程序的转变，其缺失导致轴突导向基因的持续表达，破坏了MF靶向的精确性。

特别值得注意的是，Robo1、Ephb1、Dcc和Nrp1等关键轴突导向受体的异常表达可能共同导致了MF靶向缺陷。其中，Ephb1已知通过CA3神经元中的反向信号调控MF修剪和靶向，而Nrp1作为semaphorin 3的共受体，其表达上调可能改变Sema3E-plexin-D1信号从排斥向吸引的转换，促进对CA3胞体层的异常靶向。

研究还发现表达Ntng1的成熟颗粒神经元亚群的减少，这些细胞可能在后期发育中参与MF靶向的精细化调节。NTNG1及其配体NGL-1此前被证明在内嗅皮层-齿状回通路中调节层特异性树突分段，可能在海马环路组装中发挥类似作用。

从临床角度，本研究为理解CIC相关神经发育障碍的病理机制提供了重要线索。MF-CA3连接的破坏和Ntng1⁺颗粒神经元的缺失可能共同导致海马功能异常，从而解释患者中出现的学习记忆缺陷和癫痫症状。这些发现不仅深化了对海马神经环路发育机制的理解，也为相关神经发育障碍的治疗策略开发提供了新的分子靶点。