RIP1通过VEGF-C/NF-κB通路促进结直肠癌进展与淋巴管重塑的机制研究

本研究揭示RIP1（Receptor-interacting protein kinase 1）在结直肠癌（CRC）中通过激活NF-κB通路正向调控VEGF-C表达，促进肿瘤增殖、迁移及淋巴管生成。敲低RIP1可抑制体内外肿瘤生长和血管生成，表明其作为CRC治疗靶点的潜力。

　　

ABSTRACT

受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）在炎症和细胞存活中发挥调控作用，但其在结直肠癌（CRC）特别是肿瘤微环境中淋巴改变方面的参与仍不明确。本研究通过qRT-PCR和Western blot检测CRC组织及癌旁正常样本中RIP1和VEGF-C的表达，分析其相关性，并利用RIP1沉默和再表达的HT29和SW480细胞进行功能实验。评估细胞增殖、迁移和集落形成能力，同时检测NF-κB报告基因活性。应用LPS刺激的CRC细胞条件培养基评估淋巴管内皮细胞的管腔形成能力。通过异种移植模型验证体内肿瘤生长和血管变化。结果显示RIP1在CRC组织中升高，且与VEGF-C表达呈正相关。敲低RIP1可降低细胞生长、迁移、VEGF-C水平和NF-κB活性，这些变化通过恢复RIP1过表达部分逆转。RIP1缺陷细胞的条件培养基损害淋巴管内皮细胞的管腔形成。在小鼠模型中，RIP1沉默抑制肿瘤生长，降低微血管密度和Ki67阳性细胞数。研究表明RIP1通过促进VEGF-C表达和NF-κB通路激活推动CRC进展，可能参与CRC生长和淋巴重塑，提示RIP1作为CRC干预的潜在靶点。

1 Introduction

结直肠癌（CRC）是全球最常见和致死性恶性肿瘤之一。尽管早期检测和联合治疗改善了局部病例的生存率，但由于复发和淋巴转移，晚期CRC的预后仍然较差。标准治疗方法通常无法有效抑制转移，尤其是当淋巴管生成参与时。这凸显了识别不仅驱动肿瘤进展而且影响淋巴微环境的分子决定因素的迫切需求。在此背景下，揭示淋巴重塑的调控机制——特别是那些与炎症相关的机制——可能为靶向CRC治疗提供新方向。

受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）是一种多功能介质，参与凋亡、坏死性凋亡和炎症。作为中央信号整合器，RIP1可根据细胞和分子条件发挥肿瘤抑制或肿瘤促进作用。据报道，它通过调节巨噬细胞行为促进胰腺癌中的免疫 evasion，并通过激活IKK/NF-κB轴增强乳腺癌转移。在CRC中，新兴研究表明RIP1参与多种致癌通路，如WNT/β-catenin驱动的上皮-间质转化（EMT）和caspase非依赖性坏死性凋亡。此外，RIP1通过与泛素修饰酶的相互作用调节细胞对死亡信号的敏感性。然而，其在CRC进展中的具体作用——特别是在淋巴重塑方面——仍不明确。

机制上，RIP1主要通过泛素依赖性复合物组装和支架介导的相互作用贡献于NF-κB激活。它可通过含RHIM结构域的适配蛋白如TRIF和DAI激活，其K63连接的多聚泛素化促进下游NF-κB激活。缺乏此修饰时，RIP1倾向于参与促死亡信号级联，包括凋亡和坏死性凋亡。此外，RIP1通过NF-κB非依赖性途径调节TRAF2稳定性和炎症细胞因子输出。这些多功能特性将RIP1置于炎症、细胞命运决定和肿瘤-微环境相互作用的交汇点——这些过程日益涉及CRC转移。

淋巴重塑，包括淋巴管生成和现有血管的结构重组，是癌细胞扩散的关键步骤。在CRC中，增加的淋巴管密度常与淋巴结受累和不良预后相关。VEGF-C是公认的促淋巴管生成因子，但其在CRC中表达的上游信号事件仍不完全清楚。VEGF-C通过VEGFR-3促进淋巴管内皮增殖和迁移，其转录受多种通路调控，尤其是NF-κB。持续性NF-κB激活与CRC进展和转移部分相关，通过诱导VEGF-C表达。然而，RIP1——作为上游炎症信号组件——是否参与CRC中的这一调控网络尚待阐明。

本研究探讨了RIP1在CRC中的潜在作用，重点关注其与淋巴重塑和肿瘤促进性炎症的关联。通过整合临床组织分析、体外功能实验和体内肿瘤模型，我们检测了RIP1表达、NF-κB活性和VEGF-C水平之间的关系。虽然先前研究主要强调RIP1在细胞死亡调控中的作用，但本研究突出了其在塑造肿瘤微环境中的潜在参与。这些见解可能有助于更广泛理解RIP1在CRC生物学中的功能，并支持其作为转移干预策略的候选靶点探索。

2 Materials and Methods

2.1 Clinical Sample Collection

从深圳市福田区第二人民医院接受根治性手术切除的患者中收集60对CRC和相应癌旁正常组织。所有入组患者术前未接受化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗。组织标本在切除后立即收集，经病理检查确认，并在无菌条件下处理。样品迅速冷冻于液氮中并储存于-80°C。所有涉及人体样本的程序均经深圳市福田区第二人民医院机构伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意。

2.2 Cell Culture

人CRC细胞系（SW620、HT29、LOVO、SW480和HCT116）和正常结肠上皮细胞（FHC）购自中国科学院细胞库（上海，中国）。人淋巴管内皮细胞（HLEC）购自ScienCell Research Laboratories（美国），并在内皮细胞培养基（ECM, ScienCell）中添加1%内皮细胞生长补充物（ECGS）和5%胎牛血清（FBS, Gibco）于37°C、5% CO₂条件下培养。CRC细胞维持在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM, Gibco, 美国）或RPMI-1640培养基（Gibco, 美国）中，添加10% FBS（Gibco）于37°C、5% CO₂条件下。FHC细胞在DMEM/F12培养基（Gibco, 美国）中添加10% FBS（Gibco）于37°C、5% CO₂条件下培养。

2.3 Cell Transfection

SW480和HT29细胞用编码特异性靶向RIP1的shRNA的慢病毒颗粒（GeneChem, 上海, 中国）感染，在5 μg/mL polybrene（Sigma-Aldrich, 美国）存在下，并使用嘌呤霉素（2 μg/mL, Sigma-Aldrich）选择稳定克隆。对于挽救实验，RIP1沉默细胞用RIP1过表达质粒（pcDNA3.1-RIP1, GeneChem）或空载体使用Lipofectamine 3000（Invitrogen, 美国）按照制造商指令转染。设四个实验组：NC（阴性对照）、sh-RIP1、sh-RIP1 + Vector和sh-RIP1 + OE-RIP1。

2.4 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从组织标本和处理的细胞中提取总RNA，按照制造商指令操作。检测RNA浓度和纯度后，用1 μg RNA通过PrimeScript RT试剂盒（Takara, 日本）合成cDNA。使用Green Premix Ex Taq II（Takara Bio Inc., 日本）在CFX96实时PCR系统（Bio-Rad, 美国）上进行qRT-PCR。使用2^-ΔΔCt方法计算相对表达。RIP1、VEGF-C和GAPDH的引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2.5 Western Blot

使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂cocktails（MedChemExpress, 美国）的RIPA缓冲液（Beyotime, 中国）收集总蛋白。蛋白定量后，30 μg蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（Millipore, 美国）上。膜用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4°C overnight与靶向RIP1、VEGF-C、IκBα、p-IκBα、TAK1、NEMO和GAPDH（均来自Cell Signaling Technology, 美国）的一抗孵育。洗涤后，膜与HRP偶联的二抗（Jackson ImmunoResearch, 美国）孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）试剂盒（Bio-Rad, 美国）进行信号检测。

2.6 CCK-8

简要地，将转染的细胞（2 × 10³细胞/孔）接种到96孔板中，设六个重复孔。孵育0、24和48小时后，每孔加入10 μL CCK-8溶液（Dojindo Laboratories, 日本），细胞在37°C进一步孵育2小时。使用酶标仪（BioTek, 美国）记录450 nm吸光度。

2.7 Colony Formation Assay

将处理的CRC细胞（500细胞）接种到6孔板中，在完全培养基中维持14天。终点时，用4%多聚甲醛（PFA; Solarbio, 中国）固定可见集落15分钟，随后用0.5%结晶紫（Beyotime, 中国）染色20分钟。洗涤后，使用倒置光学显微镜（Olympus, 日本）手动计数含50个以上细胞的集落。

2.8 Wound Healing

将处理的SW480和HT29细胞在6孔板中培养直至形成均匀单层。细胞达到完全汇合后，使用无菌200 μL移液器头制造直线划痕。通过用PBS（HyClone, 美国）轻轻冲洗两次去除脱落细胞，并将培养基更换为无血清培养基。立即（0小时）和48小时后使用倒置显微镜（Olympus, 日本）捕获伤口区域图像。

2.9 Transwell Assay

血清饥饿12小时后，将转染的CRC细胞（1 × 10⁵细胞, 200 μL）在无血清培养基中接种到Transwell小室（Corning, 美国）的上室。下室填充含15% FBS的600 μL培养基。然后允许细胞在37°C、5% CO₂下迁移48小时。轻轻去除未迁移细胞。迁移细胞用4% PFA固定15分钟并染色。洗涤后，在光学显微镜（Olympus, 日本）下成像五个随机视野。

2.10 Dual-Luciferase Reporter Assay

使用双荧光素酶报告系统（Promega, 美国）评估NF-κB的转录活性。细胞在24孔板中与NF-κB荧光素酶报告质粒和Renilla荧光素酶质粒（Beyotime, 中国）使用Lipofectamine 3000（Invitrogen, 美国）共转染。24小时后，用1× Passive Lysis Buffer（Promega）裂解细胞，并使用发光计（Promega GloMax或等效设备）顺序测量发光。萤火虫荧光素酶信号归一化至Renilla荧光素酶活性。相对NF-κB活性表示为萤火虫与Renilla发光之比。

2.11 Lymphatic Tube Formation Assay

用1 μg/mL脂多糖（LPS; Sigma-Aldrich, 美国）处理转染的SW480和HT29细胞。24小时后，收集条件培养基（CM），离心并储存于4°C。将HLEC重悬于收集的CM中。将细胞（1 × 10⁴细胞/孔）接种到预涂生长因子减少Matrigel（Corning, 美国）的96孔板中，于37°C、5% CO₂下培养8小时。使用倒置显微镜（Olympus, 日本）观察管腔形成，并通过计数完整连接点数量使用ImageJ软件（NIH, 美国）进行量化。

2.12 Xenograft Tumor Model

雄性BALB/c裸鼠（4–6周龄, 16–18 g）在SPF条件下饲养，具有标准光/暗周期。所有动物程序经深圳市福田区第二人民医院批准。收集稳定表达阴性对照shRNA（NC）或靶向RIP1的shRNA（sh-RIP1）的HT29和SW480细胞，重悬于PBS（HyClone, 美国）中，并皮下注射到每只小鼠的右腹侧（5 × 10⁶细胞 in 100 μL PBS）。计算肿瘤体积。注射后28天，处死小鼠，切除肿瘤组织并称重。

2.13 Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining

肿瘤标本用4% PFA固定24小时，在梯度乙醇系列中脱水，石蜡包埋，并使用旋转切片机（Leica, 德国）切成4 μm厚切片。切片在二甲苯中脱蜡，通过递减浓度乙醇再水化，并使用商业苏木精和伊红染色试剂盒（Beyotime, 中国）按照试剂盒协议染色。染色后，幻灯片冲洗、脱水，并用中性树脂（Solarbio, 中国）封片。使用光学显微镜在适当放大倍数下观察和捕获组织学特征。

2.14 Immunohistochemistry (IHC)

石蜡包埋切片脱蜡、再水化，并在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中使用压力-based retrieval system进行热诱导抗原修复。用3%过氧化氢（Beyotime, 中国）阻断内源性过氧化物酶活性。幻灯片在4°C overnight与抗CD31（1:200, Abcam, 英国）或抗Ki67（1:400, CST, 美国）孵育。洗涤后，切片用HRP连接的二抗（ZSGB-Bio, 中国）处理30分钟。使用DAB检测试剂盒（ZSGB-Bio, 中国）可视化信号，苏木精用作核 counterstain。脱水封片后，使用光学显微镜捕获图像。

2.15 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

使用VEGFC测定试剂盒（南京建成生物工程）按照制造商指令分析培养上清液中VEGFC水平。

2.16 Statistical Analysis

所有实验至少重复三次，数据表示为平均值±标准差（SD）。使用SPSS软件（version 22.0; IBM Corp., Armonk, NY, 美国）通过Student's t检验或单因素ANOVA评估组间差异。应用Pearson相关系数评估变量间关系。p < 0.05认为具有统计学显著性。

3 Results

3.1 RIP1 Positively Correlates With VEGF-C and Activates Downstream NF-κB in CRC

对临床CRC样本的初步评估显示，与癌旁非恶性样本相比，CRC组织中RIP1 mRNA水平显著升高。VEGF-C mRNA也观察到类似趋势。对60对标本mRNA表达的统计相关性分析进一步显示，RIP1和VEGF-C表达之间存在适度但统计学显著的正相关。随后，Western blot数据证实了CRC组织中RIP1、VEGF-C、IkBa、p-IkBa、TAK1和NEMO蛋白水平相对于对照的增加。为确定下游功能实验的适当体外模型，我们通过Western blot分析检测了一组人CRC细胞系（包括SW620、HT29、LOVO、SW480和HCT116）中RIP1和VEGF-C蛋白的表达水平。FHC作为参考。所有CRC细胞系表现出不同程度的RIP1和VEGF-C表达；HT29和SW480细胞显示强大的内源性表达，被选择用于后续机制实验。为研究RIP1在影响VEGF-C表达和NF-κB活性中的调控作用，我们建立了源自HT29和SW480的稳定RIP1敲低细胞系（sh-RIP1）。为评估敲低效应的潜在逆转，细胞进一步用RIP1过表达构建体转染。Western blot结果显示，抑制RIP1降低了RIP1和VEGF-C水平，并减少了p-IκBα和IκBα表达（NF-κB激活的关键标志）。此外，RIP1沉默下调了HT29和SW480细胞中的TAK1和NEMO。当RIP1表达恢复（sh-RIP1 + OE-RIP1）时，这些因RIP1沉默而减少的蛋白部分反弹。

3.2 RIP1 Knockdown Reduces CRC Cell Proliferation In Vitro

为检查RIP1对CRC细胞增殖的功能影响，在具有稳定RIP1敲低和过表达的SW480和HT29细胞中进行CCK-8实验。RIP1沉默细胞在24和48小时均表现出降低的细胞活力。引入空载体未改变此抑制效应，而RIP1表达的恢复部分挽救了增殖潜力。集落形成实验进一步验证了RIP1沉默在延长时期内对细胞生长的抑制作用。与对照组相比，具有RIP1沉默的SW480和HT29细胞形成显著更少的集落。在sh-RIP1背景中过表达RIP1将克隆形成能力恢复到相当程度。因此，RIP1有助于CRC细胞的增殖能力。

3.3 RIP1 Knockdown Suppresses Migration Ability of CRC Cells

为探索RIP1对CRC细胞运动性的影响，在RIP1沉默的SW480和HT29细胞中进行伤口愈合实验。与NC组相比，具有RIP1敲低的细胞在48小时内关闭划痕区域的能力显著降低。引入空载体无 discernible 效应，而RIP1再表达导致迁移的部分恢复。Transwell实验中获得一致结果。迁移细胞在sh-RIP1组中 declined。在敲低背景中重新引入RIP1部分恢复了两种细胞系的迁移能力。这些发现证明RIP1功能性地参与维持CRC细胞的迁移潜力。

3.4 RIP1 Promotes NF-κB Activation and Facilitates Lymphatic Tubulogenesis Induced by CRC Cells

为确定RIP1是否影响NF-κB，我们应用双荧光素酶报告系统量化CRC细胞中的转录活性。RIP1过表达增强了荧光素酶活性，表明NF-κB通路激活增加。接下来，为评估RIP1对肿瘤诱导淋巴管生成的影响，我们收集了来自非LPS或LPS刺激的具有不同处理的CRC细胞的条件培养基，与HLEC共培养。在SW480和HT29模型中，RIP1敲低显著减少了毛细血管样结构的形成，通过连接点数量和参与细胞的下降证明。相反，RIP1表达的恢复部分挽救了此能力。在两种细胞系中，我们还发现sh-RIP1组中VEGFC水平明显低于NC组。RIP1过表达显著增加了条件培养基中的VEGFC水平。因此，RIP1可促进响应炎症刺激的促淋巴管生成信号。

3.5 RIP1 Silencing Suppresses Tumor Growth and Reduces Microvessel Density in a CRC Xenograft Model

为评估RIP1在体内肿瘤进展中的作用，将具有稳定RIP1敲低的CRC细胞皮下注射到裸鼠中，NC组作为对照。在整个28天观察期内，sh-RIP1组中的肿瘤体积以显著慢于对照的速度增加。研究结束时，RIP1缺陷组中的肿瘤大小和重量均显著减少。H&E染色显示sh-RIP1组中细胞密度和有丝分裂活性降低。为研究RIP1是否影响肿瘤血管生成，我们进行CD31 IHC以标记内皮细胞。源自RIP1沉默细胞的肿瘤表现出比对照组更低的微血管密度。此外，Ki67 IHC染色显示RIP1敲低肿瘤中增殖细胞比例明显减少。NC组中淋巴管内皮细胞特异性标志物的表达显著高于sh-RIP1组。Western blotting结果显示sh-RIP1肿瘤中RIP1、IkBa、p-IkBa、TAK1、NEMO、CD31、VEGF、LYVE-1和PCNA的表达低于NC组。这些发现共同支持RIP1在促进CRC增殖和血管发育中的促肿瘤作用。

4 Discussion

CRC仍然是一个紧迫的全球健康挑战，并常伴有通过淋巴系统的转移。淋巴管生成——新淋巴管形成的过程——日益被认为是癌细胞扩散的关键使能者，并与CRC的不良临床结果密切相关。尽管VEGF-C及其受体VEGFR-3是此过程的 well-established 介质，但控制VEGF-C在CRC中表达的上游调控网络仍不充分阐明。

在本研究中，我们通过识别RIP1作为CRC中VEGF-C表达和肿瘤相关淋巴重塑的潜在调节器提供了新颖视角。虽然RIP1传统上以其在坏死性凋亡、凋亡和炎症中的作用而闻名，但新兴研究已 implicating 它在致癌过程中。例如， elevated RIP1表达已显示通过AKT/Bcl-2/BAX轴促进肝细胞癌中的肿瘤进展，并通过调节G2/M细胞周期检查点增强卵巢癌中的细胞增殖。

专注于CRC，Kang等人最近揭示RIP1在WNT/β-catenin信号轴内功能，直接与β-catenin相互作用以稳定其表达并增强EMT，最终驱动转移。这些数据强调了RIP1在CRC和其他恶性肿瘤中的致癌潜力。

我们的实验结果进一步支持这一概念：与癌旁非癌组织相比，RIP1在CRC组织中显著上调，其表达与VEGF-C水平呈正相关。在HT29和SW480细胞中沉默RIP1导致增殖和迁移能力降低以及VEGF-C表达下调。同时，我们观察到NF-κB活性降低以及关键NF-κB相关组件（包括p-IκBα、TAK1和NEMO）的表达抑制。这些发现与先前研究一致，表明RIP1可通过RHIM结构域相互作用和K63连接的多聚泛素化促进NF-κB激活，作为下游生存促进信号模块的支架。

此外，RIP1驱动的NF-κB激活已涉及多种癌症类型中的炎症细胞因子产生和转移进展。例如，发现RIP1激活上调IL-1β表达，从而通过NF-κB在辐射诱导的肺癌模型中促进EMT和侵袭行为。这些观察表明RIP1可能至少部分通过NF-κB依赖性机制调节CRC中的VEGF-C转录。尽管如此，我们承认此结论仍然是相关的；涉及NF-κB通路抑制或直接启动子结合实验的额外调查 warranted 以验证因果关系。

值得注意的是，源自RIP1耗竭CRC细胞的条件培养基显著减弱了HLEC的管腔形成，表明RIP1参与促进淋巴管生成信号。这一发现与胆囊癌的结果一致，其中显示RIP1通过NF-κB调节VEGF-C依赖性淋巴管生成。此外，RIP1已涉及其他癌症中的淋巴转移，包括肺腺癌和结直肠模型，其中它通过NF-κB链接机制调节VEGF-C。这些报告共同支持RIP1在驱动肿瘤相关淋巴管生成中的保守作用。

我们的结果也补充了早期研究，证明NF-κB是各种恶性肿瘤中VEGF-C的转录驱动者。持续性NF-κB与增强的VEGF-C表达、淋巴管形成和淋巴结转移相关。例如，显示visfatin通过MEK/ERK和NF-κB通路上调VEGF-C并促进食管鳞癌中的淋巴管生成。此外，NF-κB已涉及在炎症和癌症设置中调节VEGF-C/VEGFR-3活性，包括在巨噬细胞和甲状腺癌中。尽管如此，RIP1、NF-κB和VEGF-C在CRC中的直接链接先前未建立。我们的研究是首批提出这种关联的研究之一，将RIP1定位为VEGF-C介导淋巴管生成的潜在上游调节器。

然而，我们的研究也有一些局限性。虽然RIP1敲低导致NF-κB和VEGF-C表达减少，但直接调控关系仍需通过分子机制实验如ChIP-qPCR或荧光素酶报告构建体确认。尽管我们的体内实验证明了减少的肿瘤负荷和微血管密度，但我们未直接评估淋巴管密度或转移扩散。未来研究采用淋巴标志物如LYVE-1或podoplanin， alongside 前哨淋巴结评估，将有助于澄清RIP1在淋巴转移级联中的作用。

鉴于对RIP1作为免疫和淋巴过程调节器的新兴理解，我们的发现具有治疗意义。小分子RIP1抑制剂如Necrostatin-1，虽然最初开发用于阻断坏死性凋亡，但也被报道干扰促肿瘤性NF-κB。在此背景下，治疗性靶向CRC中的RIP1可能通过限制肿瘤增殖和VEGF-C驱动的淋巴管生成提供双重益处。此策略可能在治疗以高炎症或淋巴管生成活性为特征的转移性CRC亚型中特别有价值。

5 Conclusion

总之，我们的发现表明RIP1通过其与NF-κB激活和VEGF-C上调的关联贡献于CRC进展。通过影响肿瘤生长、迁移和淋巴微环境，RIP1成为一个有前景的治疗靶点。进一步阐明其在淋巴管生成中的机制作用可能支持其在抗转移CRC治疗中的转化应用。

Author Contributions

M.L.和H.L.：初步草稿撰写和实验数据分析。M.L.：研究资源收集和实验结果可视化。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。