Necroptosis（坏死性凋亡）与神经炎症在db/db小鼠脑小血管病(CSVD)相关认知衰退中的作用机制研究

本综述深入探讨了糖尿病相关脑小血管病(CSVD)的分子机制，首次揭示了RIP1/RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡（necroptosis）通路与神经炎症在db/db小鼠CSVD相关认知障碍中的协同作用。研究通过多模态方法证实，高血糖通过时空依赖性激活坏死性凋亡通路，导致血脑屏障破坏（↓Occludin/ZO-1, ↑VEGFA）和神经炎症（↑IL-6/TNF-α/NF-κB），从而驱动认知功能下降，为靶向坏死性凋亡通路治疗糖尿病相关认知缺陷提供了新的潜在治疗策略。

　　

引言

脑小血管病(CSVD)是一种涉及脑动脉、微动脉、毛细血管、静脉和微血管的疾病，其病理特征包括血脑屏障破坏、微血管渗漏和慢性低灌注，临床特点为卒中、认知障碍和情绪障碍风险显著增加。近年来，2型糖尿病(T2DM)已被认为是CSVD的重要致病因素，约40%的T2DM患者存在CSVD影像学标志物，如脑白质高信号或微出血，且与认知衰退程度正相关。尽管高血糖诱导的氧化应激和晚期糖基化终末产物(AGEs)积累被认为是糖尿病相关CSVD的潜在机制，但程序性微血管内皮细胞死亡（坏死性凋亡）和系统性炎症在疾病进展中的协同作用尚不清楚，这可能是连接代谢紊乱与中枢微环境失衡的关键枢纽。

与常规凋亡不同，坏死性凋亡是一种由RIP1/RIP3/MLKL信号轴介导的程序性坏死形式，其特征是细胞膜破裂和损伤相关分子模式(DAMPs)释放，触发强烈的炎症反应。在糖尿病等慢性代谢性疾病中，持续高血糖通过激活RIP1激酶诱导内皮细胞坏死性凋亡，导致微血管渗漏和局部炎症放大。这种“细胞死亡-炎症”正反馈机制在急性缺血性卒中中已得到证实，但其在糖尿病相关CSVD慢性进展中是否起主导作用仍未知。db/db小鼠因瘦素受体缺陷自发发展为严重T2DM，其特征为胰岛素抵抗、慢性高血糖和脑微血管病理（如血脑屏障通透性增加、白质稀疏）。本研究选择db/db小鼠作为研究对象，通过多模态手段整合多组学工具解析CSVD的进化模式：结合Morris水迷宫、磁共振成像和组织病理学评估CSVD表型；通过检测紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）和促血管生成因子(VEGF-A)探索血脑屏障完整性；通过分析RIP1/RIP3/MLKL的mRNA和蛋白表达及组织定位，并量化血浆IL-6、TNF-α和NF-κB水平探索分子机制。本研究首次揭示了RIP1/RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡和炎症反应在糖尿病CSVD中的协同作用，为靶向干预糖尿病相关认知障碍提供了新视角。

材料与方法

实验动物与分组

18只6周龄清洁级雄性db/db小鼠购自江苏华创生诺医药科技有限公司[动物许可证号：SCXK(苏)2020-0009]。12只6周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠购自中国三峡大学健康科学中心[动物许可证号：SCXK(鄂)2020-0012]。所有小鼠饲养于标准无特定病原体(SPF)实验室笼中，笼具、饮水瓶、垫料等物品均经高压灭菌，小鼠自由饮水，并在正式实验前在实验室环境中适应2周。基于预实验数据（效应量d=1.8，α=0.05，β=0.2）使用G*Power 3.1计算，每组至少需要4只（野生型）或6只（db/db）小鼠以达到80%统计效力。小鼠随机分为以下组别：WT组（n=12）：随机分为8W、12W、16W亚组（n=4/组）；db/db组（n=18）：随机分为8W、12W、16W亚组（n=6/组）。实验周期：总时长16周。本研究经山西白求恩医院伦理委员会批准（批准号：SBQKL-2021-060）。

主要实验试剂与仪器

主要实验试剂包括occludin、ZO-1（Proteintech, USA）、VEGF-A（Abcam, UK）、RIP1、RIP3（Bioss, Beijing）、MLKL（Affinity, USA）抗体；TsingZol总RNA提取试剂盒、SynScript III cDNA合成Mix试剂盒和2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）试剂盒（Tsingke, Tianjin）；IL-6、IL-10、TNF-α、NF-κB酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒（Elabscience, Wuhan）。主要仪器包括Morris水迷宫视频分析系统（北京中视迪创科技发展有限公司）、小动物磁共振成像系统（Bruker, Germany）、凝胶成像系统（Bio-Rad, USA）、实时荧光定量PCR检测仪（ABI, USA）和透射电子显微镜（Hitachi, Japan）。

方法

血糖测量

小鼠分组后，在血糖测试前实施6小时禁食（20:00至次日2:00），尾静脉采血前局部涂抹2%利多卡因凝胶（Sigma; L5647）以减少应激性高血糖，尾部用75%医用酒精擦拭，静脉扩张后使用采血针穿刺尾静脉，在小鼠清醒平静状态下测量尾静脉空腹血糖，每只小鼠测量两次，记录平均值。

水迷宫测试

Morris水迷宫(MWM)包括空间导航实验和空间探索实验两部分。首先，将小鼠放入无平台的池中自由游泳1分钟以适应迷宫，随后将小鼠放在平台上10秒以建立平台与逃脱的关联。之后，将小鼠面向池壁从I象限（离平台最远）释放并开始计时，当小鼠爬上平台并停留5秒时结束试验。如果小鼠在60秒内未能到达平台，潜伏期记录为60秒。每次试验后，将小鼠放在平台上10秒，擦干后放回笼中。此过程在剩余三个象限重复，每只小鼠每天测试所有四个象限，连续四天。第五天，在相同环境和水温条件下，移除原始平台，将小鼠从I象限面向池壁释放进行单次测试，记录60秒游泳轨迹。使用视频分析系统跟踪记录游泳行为、轨迹、逃避潜伏期、穿越原平台位置次数等相关指标。

磁共振成像(MRI)检查

使用Bruker 7.0T小动物成像系统进行MRI检查，进行多片快速采集弛豫增强(RARE)-T2扫描（冠状位）和RARE-T2-Flair扫描（轴位、矢状位和冠状位），参数如下：重复时间(TR)=2743.9625 ms，回波链长度=8，回波时间(TE)=33 ms，视野(FOV, 矩形)=20×20 mm，矩阵大小=256×256×18，体素大小=0.078125×0.078125×0.6 mm。每次RARE-T2扫描约14分钟，RARE-T2-Flair扫描约15分钟。

苏木精-伊红(HE)染色

新鲜小鼠脑组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋并切片，切片脱蜡并通过梯度酒精系列再水化30分钟，磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，用苏木精染色5分钟突出核成分，随后水洗并用1%伊红水溶液染色5分钟染色细胞质。

透射电镜观察

脑组织在0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）配制的1%锇酸溶液中室温避光固定2小时，固定和脱水后，渗透、包埋并切片，切片用2%醋酸铀和2.6%柠檬酸铅染色，最后在透射电镜下观察标本。

Western Blot分析

脑组织使用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液裂解，使用 bicinchoninic acid (BCA)蛋白测定试剂盒测量总蛋白浓度，95°C变性5分钟后，蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉封闭，膜在4°C overnight孵育occludin、ZO-1、VEGF-A、RIP1、RIP3、MLKL和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗（稀释比见表1），PBS with Tween 20 (PBST)洗涤后，室温孵育辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗1小时，通过暴露膜于化学发光试剂2.0秒可视化蛋白条带，使用ImageJ 2.0软件分析条带灰度值。

实时荧光定量PCR检测(RT-qPCR)

使用TsingZol总RNA提取试剂盒结合Trizol法提取总RNA，使用SynScript III cDNA合成Mix试剂盒将提取的RNA反转录为互补DNA(cDNA)，使用2×TSINGKE Master qPCR Mix试剂盒在荧光定量PCR仪上对所得cDNA进行扩增和检测。PCR反应条件如下：95°C初始变性1分钟（一个循环），随后95°C变性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸15秒共40个循环，收集并分析数据（引物序列见表2）。

免疫组织化学

石蜡包埋切片脱蜡后，使用电陶瓷加热器进行抗原修复，随后阻断内源性过氧化物酶活性，切片在含3%牛血清 albumin (BSA)的PBS中4°C overnight孵育RIP1、RIP3、MLKL一抗，随后室温孵育二抗30分钟，切片用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色液染色并用苏木精复染核，最后在显微镜下分析图像，棕黄或棕黄色染色表示阳性信号。

酶联免疫吸附测定(ELISA)检测

麻醉小鼠并从腹主动脉采血，全血样品室温静置2小时后3000 rpm离心10分钟，收集血清上清并-80°C保存，按照ELISA小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-10、小鼠NF-κB ELISA试剂盒操作说明进行检测。

结果

血糖测量

WT小鼠和db/db小鼠的空腹血糖水平分别为8.32±0.46和25.38±1.59 mmol/L，与WT小鼠相比，db/db小鼠空腹血糖水平显著更高，差异有统计学意义（p<0.001）。

Morris水迷宫测试

为评估高血糖对db/db小鼠CSVD认知功能的渐进影响，我们使用MWM评估了8、12、16周龄WT和db/db小鼠的空间学习和记忆能力（结果见图1A,B）。在db/db小鼠中，Morris水迷宫第3天和第4天的逃避潜伏期更长，在目标象限游泳时间百分比更低，平台穿越次数减少（p<0.001）。

水迷宫定位导航实验

（1）组间比较：与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠第2天水迷宫逃避潜伏期延长有统计学差异（p<0.05），第3天和第4天逃避潜伏期显著延长（p<0.001）。（2）组内比较：不同周龄WT小鼠第1-4天水迷宫逃避潜伏期无显著差异（p>0.05）；与db/db-8W相比，db/db-12W和db/db-16W小鼠第4天逃避潜伏期显著延长（p<0.001）。

水迷宫空间探索实验

（1）组间比较：与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠在目标象限游泳时间百分比有统计学显著差异（p<0.001），平台穿越次数显著减少（p<0.001）。（2）组内比较：与WT-8W相比，WT-16W小鼠在目标象限游泳时间百分比和平台穿越次数增加（p<0.05）；与db/db-8W相比，db/db-16W小鼠在目标象限游泳时间百分比显著降低（p<0.01），db/db-12W和db/db-16W小鼠平台穿越次数显著更低（p<0.01, p<0.001）。

基于MRI的CSVD小鼠影像学发现

CSVD可能代表脑微血管功能障碍的表现，并作为与各种小血管结构和功能改变相关的潜在脑实质损伤的指标。图2显示MRI结果。磁共振成像显示，8、12、16周龄WT小鼠在T2WI和FLAIR序列中显示脑组织形态饱满，未见明显异常信号；8周和12周龄db/db组小鼠在T2WI和FLAIR序列中的信号与WT组无显著差异；16周龄db/db小鼠显示双侧颞叶沟增宽和轻度颞叶萎缩，以及四脑室扩大。在冠状面，与16周龄WT小鼠相比，db/db小鼠T2WI图像中可见新发点状低信号。

通过HE染色和Western Blot评估脑微血管结构和功能

脑微血管是血脑屏障的关键组成部分，其通透性反映微血管功能。血脑屏障通透性可通过神经影像学或生化方法评估。本研究通过western blot分析血脑屏障紧密连接蛋白（occludin和ZO-1）和VEGF-A的表达来评估脑微血管功能（图3）。

Occludin、ZO-1和VEGFA蛋白表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠occludin、ZO-1蛋白表达显著降低（p<0.001）。db/db-16W组ZO-1降低至0.68倍（vs. WT-8W, p<0.001），occludin降低至0.48倍（vs. WT-8W, p<0.001）。与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠VEGFA蛋白表达显著更高（p<0.001）。db/db-16W组VEGFA增加2.87倍（vs. WT-8W, p<0.001），反映血脑屏障完整性随糖尿病病程严重受损。

通过HE染色和透射电镜观察脑组织神经元损伤

WT小鼠大脑细胞丰富且排列有序，但db/db-8W小鼠大脑皮层显示轻度损伤，部分脑细胞显示深染和核固缩，db/db-12W小鼠显示大脑皮层细胞排列明显紊乱、广泛细胞损伤和深染固缩核，db/db-16W小鼠显示显著局部脑组织损伤、皮质结构破坏、广泛细胞损伤和深染固缩核（图4A,B）。

电镜下，所有WT小鼠显示完整的核和核膜结构，胞浆中线粒体呈圆形或短棒状，大多数胞浆结构完整。但db/db-8W小鼠显示胞浆线粒体空泡变性，部分线粒体发生自噬，db/db-12W小鼠显示胞浆细胞器结构破坏和可见自噬体，db/db-12W小鼠线粒体肿胀后期双膜结构破坏，db/db-16W小鼠显示视野内细胞器数量减少、可见自噬体、核膜结构破裂边界不清以及线粒体肿胀后期广泛空泡变性（图4C）。

通过RT-qPCR检测RIP1、RIP3和MLKL的mRNA表达水平

对db/db小鼠脑组织坏死性凋亡标志物进行检测，重点关注RIP1、RIP3和MLKL的mRNA表达水平（图5）。

RIP1 mRNA表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠RIP1 mRNA表达显著更高（p<0.001）。db/db-8W表达升高至1.85倍；db/db-12W组：表达升高至3.02倍；db/db-16W组：表达升高至4.15倍（p<0.001），表明糖尿病病程晚期坏死性凋亡信号显著增强。

RIP3 mRNA表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W小鼠RIP3 mRNA表达增加（p<0.05）；db/db-12W和db/db-16W小鼠RIP3 mRNA表达显著增加（p<0.001）。db/db-12W组：表达升高至2.45倍（p<0.001）。db/db-16W组：进一步升高至3.12倍（p<0.001）。

MLKL mRNA表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠MLKL mRNA表达显著更高（p<0.001）。db/db组MLKL表达随病程（8周→16周）呈阶梯式增加（2.18倍→4.02倍），表明病程越长，细胞死亡越不可逆。

使用Western Blot分析检测RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达水平

使用western blot分析检测db/db小鼠脑组织中坏死性凋亡标志物RIP1、RIP3和MLKL的蛋白表达水平（图6）。

RIP1蛋白表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠RIP1蛋白表达显著更高（p<0.001）。db/db-16W组：3.65倍（vs. WT-8W, p<0.001），且RIP1在糖尿病模型中随时间（8周→16周）依赖性显著升高，表明糖尿病模型小鼠随疾病进展坏死性凋亡通路显著激活。

RIP3蛋白表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠RIP3蛋白表达显著更高（p<0.001）。db/db-8W组：RIP3升高至1.53倍（p<0.001），表明坏死性凋亡通路在糖尿病早期已被激活。db/db-16W组：RIP3进一步升高至1.89倍（p<0.001），表明长期高血糖环境加剧了坏死性凋亡通路的持续激活。

MLKL蛋白表达

与WT-8W小鼠相比，db/db-8W、db/db-12W、db/db-16W小鼠MLKL蛋白表达显著更高（p<0.001）。db/db-8W组：MLKL升高至2.01倍（p<0.001），MLKL表达加倍表明坏死性凋亡信号已传递至下游执行阶段，可能直接导致细胞膜完整性破坏，当疾病进展至16周时MLKL升高至3.12倍，表明持续代谢紊乱引发不可逆细胞死亡积累。

使用免疫组织化学染色检测RIP1、RIP3和MLKL表达水平

使用免疫组织化学染色观察各组小鼠额叶皮层RIP1、RIP3和MLKL的表达水平（图7）。

RIP1免疫组织化学染色

与WT-8W小鼠相比，db/db-12W和db/db-16W小鼠RIP1表达显著更高（p<0.001）。db/db-12W组：1.86倍（vs. WT-8W, p<0.001），db/db-16W组：2.69倍（vs. WT-8W, p<0.001）。免疫组化染色加深，阳性细胞数量增加。

RIP3免疫组织化学染色

与WT-8W小鼠相比，db/db-16W小鼠RIP3表达显著更高（p<0.001）。db/db-16W组：2.81倍（vs. WT-8W, p<0.001）。免疫组化染色加深，阳性细胞数量增加。

MLKL免疫组织化学染色

与WT-8W小鼠相比，db/db-12W小鼠MLKL表达增加（p<0.05）；db/db-16W小鼠MLKL表达显著增加（p<0.001）。db/db-12W组：1.86倍（vs. WT-8W, p<0.05），db/db-16W组：2.64倍（vs. WT-8W, p<0.001）。免疫组化染色加深，阳性细胞数量增加。

使用ELISA检测血浆IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平

使用ELISA测量各组小鼠血浆IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平（图8）。

IL-6血浆水平测定

与WT-8W小鼠相比，db/db-12W小鼠血浆IL-6水平增加（p<0.01）；db/db-16W小鼠血浆IL-6水平显著增加（p<0.001）。WT-16W：IL-6浓度较WT-8W升高2.22倍（p<0.01）表明衰老过程中低度炎症自然积累，但程度远低于糖尿病模型（3.81倍 vs. 2.22倍），反映长期代谢紊乱导致炎症信号持续放大。

血浆TNF-α含量测定

与WT-8W小鼠相比，db/db-12W和db/db-16W小鼠血浆TNF-α含量显著更高（p<0.001）。db/db小鼠血浆TNF-α含量随病程（8周→16周）呈阶梯式增加（1.95倍→4.23倍）。

血浆NF-κB含量测定

与WT-8W小鼠相比，db/db-12W和db/db-16W小鼠血浆NF-κB水平显著更高（p<0.001）。db/db小鼠血浆NF-κB含量随病程（8周→16周）呈阶梯式增加（1.90倍→3.56倍），表明早期炎症激活和晚期不受控炎症导致组织损伤增加。

血浆IL-10含量测定

与WT-8W小鼠相比，db/db-16W小鼠血浆IL-10含量显著更高（p<0.001）。表明炎症反应持续增强，通过增强抗炎信号平衡IL-6、NF-κB和TNF-α的促炎作用。

讨论

本研究通过联合多组学分析揭示了关键证据：糖尿病（db/db小鼠模型）通过坏死性凋亡和炎症机制加剧脑小血管病(CSVD)相关认知缺陷：（1）认知和影像学变化：db/db小鼠在Morris水迷宫(MWM)中表现出显著空间记忆缺陷，MRI显示16周龄时存在颞叶和海马萎缩以及四脑室扩大，提示CSVD的典型影像学特征。（2）微血管病理学：HE染色显示db/db小鼠前额叶皮层毛细血管扩张、内皮增生和数量增加，且随疾病进展逐渐恶化，表明糖尿病驱动微血管重塑和功能障碍。（3）坏死性凋亡激活：db/db小鼠脑组织RIP1、RIP3和MLKL的mRNA和蛋白表达水平随病程线性增加，免疫组化显示阳性细胞数量显著增加，表明坏死性凋亡是CSVD相关认知障碍的重要机制。（4）炎症级联反应：促炎因子（IL-6、TNF-α、NF-κB）血浆水平随糖尿病进展显著增加，而抗炎因子IL-10代偿性上调，反映炎症失衡在认知障碍中的核心作用。

MWM是评估实验动物空间学习和记忆的经典认知行为任务。本研究MWM结果显示，db/db小鼠表现出更长的逃避潜伏期、更短的目标象限停留时间和更少的平台穿越次数，表明对水下平台位置的空间记忆受损。这些发现提示糖尿病与db/db小鼠病程存在显著交互作用。

与既往研究一致，可得出结论：糖尿病患者认知障碍风险更高，高血糖和糖尿病病程均与认知衰退相关。早期研究显示，12周龄db/db小鼠MWM潜伏期显著增加，24周龄db/db小鼠路径效率降低，26周龄db/db小鼠第2-4天潜伏期显著增加。我们的发现与这些观察一致。

db/db小鼠记忆损伤被发现依赖于病程，而WT小鼠未表现出年龄依赖性记忆损伤。本研究揭示的这种差异可能由三个因素解释：（1）WT小鼠保留了先前任务的记忆，而db/db小鼠没有，表明db/db小鼠缺乏训练的正向转移；（2）WT小鼠仅观察至16周，年龄对记忆损伤的影响可能未完全显现，未来研究可延长WT小鼠观察期；（3）db/db小鼠在MWM中的学习表现随糖尿病病程延长而恶化。

根据本研究MRI结果，与WT小鼠相比，16周龄db/db小鼠表现出颞叶和海马萎缩以及四脑室扩大。这些实验发现表明16周龄db/db小鼠发生CSVD。MRI提示CSVD代表脑小血管病终末期状况，这些影像学发现反映可能与小脑血管结构和功能改变相关的脑实质损伤。基于本研究分析，db/db小鼠CSVD发生与高血糖刺激相关。首先，CSVD特征与血脑屏障通透性增加相关。血脑屏障完整性在表现正常的白质中无显著异常，但在白质高信号附近发生破坏，且这种破坏与随时间出现的白质高信号严重程度相关。CSVD特征随血糖水平升高线性进展，且与血糖水平相关。其次，海马萎缩可能源于T2DM小鼠微血管改变。研究显示T2DM小鼠MRI显示皮质体积显著减少，复旦大学两项研究报告老年糖尿病小鼠海马萎缩和脑室扩大。这些发现与本研究一致，表明糖尿病可能导致微血管病变引起CSVD样表现。

本研究使用HE染色观察db/db小鼠额叶皮层微血管形态的渐进变化。结果显示，与WT小鼠相比，db/db小鼠在8、12、16周龄时额叶皮层逐渐出现毛细血管扩张、毛细血管内皮增生和毛细血管数量增加，且血管病变呈进行性加重。T2DM诱导的认知障碍可能涉及多种潜在机制。越来越多证据表明微血管功能障碍可能是这些机制之一。形态上，糖尿病患者脑微循环变化包括基底膜增厚和血管生成增加。基于分析，这种现象可归因于以下原因：（1）在糖尿病及其病程共同影响下，db/db小鼠额叶皮层微血管普遍呈现增生状态，表现为毛细血管内皮增生和毛细血管数量增加。既往研究显示糖尿病患者脑微血管基底膜显著增厚。db/db小鼠经历微血管密度增加、穿透性小动脉分支密度增加以及脑新生血管形成和重塑。（2）db/db小鼠新生血管功能障碍。研究发现T2DM导致db/db小鼠脑新生血管形成增加但功能受损。后续研究提供证据表明T2DM大鼠侧支血管数量和血管曲折度增加，但此类新形成血管壁成熟度差，表现为周细胞减少和血管通透性增加。这些因素导致糖尿病患者微血管结构变化，引起CSVD发生。

脑毛细血管形成由血管内皮生长因子(VEGF)和Wnt信号通路介导。