载脂蛋白C3（ApoC3）通过炎症驱动血管新生在周围动脉疾病中的作用机制及治疗潜力研究

本研究揭示载脂蛋白C3（ApoC3）在炎症诱导的血管新生中的关键作用，其缺失显著抑制小鼠股动脉周围套管模型中的新生血管形成（CD31+减少40%）及促血管生成基因（Hif1α/Vegf1）和炎症标志物（Cd68/Rela）表达，但不影响缺血驱动的生理性血管新生。该发现表明ApoC3是病理性血管新生的特异性调控因子，为靶向ApoC3治疗动脉粥样硬化相关周围动脉疾病（PAD）提供了新策略。

　　

1 引言

周围动脉疾病（PAD）是全球范围内导致发病率和死亡率上升的重要疾病，影响超过2亿人。PAD常见于70岁以上成年人，多累及下肢，因血流不畅导致显著疼痛和功能障碍。标准可改变的心血管疾病危险因素包括吸烟、高血压、缺乏运动和糖尿病。股动脉粥样硬化病变是疾病进展和严重程度的关键。证据支持的治疗方法包括戒烟、抗血小板和抗高血压治疗、运动疗法以及降脂策略。当疾病严重到临界肢体缺血时，常需要保肢策略（如血管内治疗和外科截肢）。改善PAD治疗以避免肢体损失和慢性疼痛的需求尚未得到满足。

血管新生是从现有血管生长出新血管的过程，对于因动脉粥样硬化闭塞引起的缺血组织血运重建至关重要。促进周围动脉病变周围新血管形成的疗法是改善下肢再灌注和预防截肢的合理方法。大量PAD治疗研究集中于利用内源性促血管生成通路来改善缺血肢体的灌注。新血管发育不仅能改善血流以减少阻塞性缺血引起的疼痛，还有助于肌肉再生和行走能力。运动和锻炼是克服PAD症状的关键，因此刺激血管新生可能有助于提高运动能力。血管内皮生长因子（VEGF）是生理性血管新生的关键调节因子，促进内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成。尽管VEGF在血管新生中起核心作用，针对VEGF通路的治疗方法在PAD临床试验中成效有限。炎症刺激可触发核因子κB（NF-κB）依赖性VEGF表达，可能驱动病理性血管新生，这与动脉粥样硬化斑块形成和癌症均相关。值得注意的是，斑块内的新血管形成日益被认为是斑块不稳定的 contributing因素。因此，在慢性缺血和炎症并存的PAD中，实现生理性和病理性血管新生之间的平衡至关重要。

载脂蛋白C3（ApoC3）最初因其促进高甘油三酯血症的作用而被认识。循环ApoC3水平升高与血脂异常、胰岛素抵抗和心血管风险增加相关。ApoC3部分通过脂蛋白脂肪酶（LPL）依赖和非依赖途径抑制甘油三酯分解。血浆甘油三酯水平升高与心血管疾病风险之间的关联已确立。高甘油三酯血症增加患2型糖尿病和PAD/慢性伤口的风险。这提示降低ApoC3可能减缓动脉粥样硬化进展并预防血管缺血。

血管炎症在PAD的发生和进展中起关键作用，导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化 initiation。越来越多的证据表明ApoC3也参与炎症。ApoC3激活NF-κB通路并诱导单核细胞/巨噬细胞活化和与内皮细胞的粘附。这表明ApoC3对血管有独立于甘油三酯的作用，降低ApoC3可能在代谢紊乱和血管缺血性疾病中具有多重优势。迄今为止，ApoC3在血管新生中的作用尚未研究。本研究旨在通过独立评估ApoC3缺失对慢性血管炎症或慢性缺血诱导的血管新生的影响，确定ApoC3是否是血管新生的关键调节因子。为此，我们使用了两种重现股血管床内源性血管新生不同方面的小鼠模型：（i）股动脉周围套管模型，先前已显示在21天后诱导套管血管周围的新血管形成、趋化因子表达和巨噬细胞浸润；或（ii）后肢缺血模型，这是通过血管新生和动脉生成进行侧支血管发育的经典模型，并在C57/B6背景小鼠中在14天内表现出逐渐再灌注。

2 材料与方法

2.1 动物研究

共使用67只雄性或雌性野生型（Apoc3^+/+）或Apoc3^?/?小鼠（B6.129-Apoc3tm1Unc/J；RRID:IMS_JAX:002057），回交10代至C57Bl/6背景。小鼠年龄8-15周，体重18-37克。小鼠来自Monash Animal Research Platform（MARP；莫纳什大学，澳大利亚）或South Australian Health and Medical Research Institute（SAHMRI）。手术前，小鼠与同窝仔一起饲养，每组3-4只动物，12小时光暗周期，自由获取正常饲料和饮用水。环境富集包括巢材如纸巾和庇护所。所有程序均根据澳大利亚《科学目的动物护理和使用规范》（第8版）进行，并获得South Australian Health and Medical Research Institute（SAM186）和莫纳什大学（项目编号：MARP/22704和MARP/36928）动物伦理委员会批准。

2.2 小鼠股动脉周围套管模型

使用股动脉周围套管炎症驱动血管新生模型，其中股动脉从神经血管束中分离，并在每只小鼠的左股动脉周围放置一个2.0 mm非闭塞性聚乙烯套管（由PE-50管制成，427 410；BD Bioscience，MA，USA）。右股动脉作为内部对照。所有手术均在吸入异氟烷（3%）诱导的麻醉下进行。麻醉维持使用2%异氟烷，并通过检查后爪 withdrawal、眨眼反射和呼吸频率定期监测。手术前，小鼠接受局部麻醉（布比卡因；2.5 mg/kg，皮下注射）和阿片类镇痛药（丁丙诺啡；0.1 mg/kg，皮下注射），并在手术后接受额外镇痛（卡洛芬；5 mg/kg，皮下注射）。

2.3 小鼠后肢缺血模型

也使用缺氧/缺血介导的血管新生后肢缺血模型，其中股血管床从神经血管束中分离，左股静脉和动脉的近端和远端用6-0丝线结扎并完全切除。右后肢作为内部对照。所有手术均在吸入异氟烷（3%）诱导的麻醉下进行。麻醉维持使用2%异氟烷，并通过检查后爪 withdrawal、眨眼反射和呼吸频率定期监测。手术前，小鼠接受局部麻醉（布比卡因；2.5 mg/kg，皮下注射）和阿片类镇痛药（丁丙诺啡；0.1 mg/kg，皮下注射），并在手术后接受额外镇痛（卡洛芬；5 mg/kg，皮下注射）。后肢血流再灌注通过MoorO₂FLO激光散斑对比（Moor Instruments，Axminster，Devon，UK）在麻醉下于基线、手术后以及手术后第3、7、10和14天测定。

2.4 mRNA表达水平测量

2.4.1 股动脉周围套管模型

使用额外队列小鼠评估套管和非套管动脉中关键血管新生和炎症基因的mRNA表达变化。在24小时后收集组织以确定对套管的早期反应。股动脉匀浆，使用TRI reagent（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）提取总RNA，并通过分光光度法定量。所有RNA样品的吸光度比（A₂₆₀/A₂₈₀）在1.8-2.0范围内，并标准化至100±3 ng/mL。总RNA（300 ng/μL）使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）反转录生成互补DNA（cDNA）。使用SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix在CFX Connect Real-Time System（Bio-Rad，Hercules，CA，USA；RRID:SCR_026760）上对cDNA进行三重定量实时PCR。

2.4.2 后肢缺血模型

从14天时间点取速冻的腓肠肌，粉碎，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，North Rhine-Westphalia，Germany）提取RNA。RNA反转录（QuantiTect Reverse Transcription Kit；Qiagen，Hilden，North Rhine-Westphalia，Germany）， resulting cDNA随后用作实时PCR中的模板，使用QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen，Hilden，North Rhine-Westphalia，Germany）在QuantStudio 7 Real-Time PCR system（ThermoFisher Scientific，USA；RRID:SCR_020245）中进行。

感兴趣的基因包括血管新生标志物：Bax、缺氧诱导因子1a（Hif1a）和血管内皮生长因子1（Vegf1）以及炎症标志物：C-C motif配体2（Ccl2）、白细胞介素-6（Il6）、Vcam1、Rela和Cd68，以及36B4或βactin作为看家基因。使用比较Ct方法计算相对于参考样品的mRNA表达 fold变化。

2.5 血浆分析

所有血浆在21或14天方案结束时收集。LPL活性使用脂蛋白脂肪酶活性测定试剂盒（ab204721；Abcam，Cambridge，MA，USA）测定。在安乐死前，小鼠通过尾静脉注射0.2 U肝素/克体重。通过离心3000 rpm 15分钟从肝素化管中收集的全血中分离血浆。在96孔板中，加入10 μL小鼠血浆（用ddH₂O调整至50 μL）至50 μL稀释底物，并将标准品加入50 μL反应混合物中。板在37°C避光孵育10分钟，使用GloMax Microplate Reader（Promega，Madison，WI，USA；RRID:SCR_026323）在Ex/Em=500–550/478读取，每10分钟一次，至少在37°C下1小时。未知样品的LPL活性从标准曲线插值得到。

总胆固醇浓度使用Cholesterol E试剂盒（439-17501；Wako Diagnostics，Mountain View，CA，USA）测定。在96孔板中，加入2 μL小鼠血浆或标准品至250 μL颜色试剂，并在37°C孵育5分钟。使用GloMax Microplate Reader在600 nm定量。未知样品的总胆固醇浓度从标准曲线插值得到。

甘油三酯水平使用Triglyceride E试剂盒（432-40201；Wako Diagnostics，Mountain View，CA，USA）测定。在96孔板中，加入2 μL小鼠血浆或标准品至250 μL颜色试剂，并在37°C孵育5分钟。使用GloMax Microplate Reader在600 nm定量。未知样品的总甘油三酯从标准曲线插值得到。

2.6 免疫组织化学

在21天股动脉套管方案结束时，通过心脏放血对小鼠实施安乐死，并通过左心室灌注盐水（10 mL）。每条腿的股动脉取出用于组织学分析，固定在4%（v/v）多聚甲醛中，石蜡包埋，并切成5 μm切片。 following柠檬酸钠抗原修复（pH 6；AJAX Finechem，Taren Point，NSW，Australia），动脉切片脱蜡、复水，并探测新血管（CD31⁺）或小动脉（平滑肌肌动蛋白）形成。切片在过氧化氢溶液（0.3% H₂O₂ in甲醇）和山羊血清（10% [v/v] 山羊血清 in PBS）中封闭，并在4°C overnight与兔抗CD31（1:25，ab28364；Abcam，Cambridge，MA，USA；RRID:AB_726362）或小鼠抗平滑肌α-肌动蛋白缀合碱性磷酸酶（1:100，A5691；Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA；RRID:AB_476746）孵育。一抗使用辣根过氧化物酶（HRP）二抗（1:200，ab6721；Abcam，Cambridge，MA，USA；RRID:AB_955447）和3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）或Vector Red碱性磷酸酶底物（SK-5100；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）检测。细胞核用苏木精复染，使用Carl Zeiss Axio显微镜和AxioCamER相机通过ZEN lite软件（Oberkochen，Baden-Württemberg，Germany）捕获图像。每个切片取一个高倍视野进行分析。

2.7 组织病理学染色

在14天后肢缺血方案结束时，通过心脏放血对小鼠实施安乐死，并分离缺血和非缺血后肢的腓肠肌用于组织学和mRNA表达分析。10%福尔马林固定、石蜡包埋的腓肠肌切片（4 μm）由Monash Histology Platform进行天狼星红或苏木精和伊红染色。使用Aperio Slide Scanning Unit（Leica Biosystems，Wetzlar，Hesse，Germany）扫描幻灯片，并使用Aperio ImageScope Software（Version 12.4.6.5003；Leica Biosystems，Wetzlar，Hesse，Germany；RRID:SCR_020993）捕获图像（20倍放大）。天狼星红染色定量以确定胶原含量百分比和肌纤维数量， centralized核从苏木精和伊红染色中通过ImageJ确定。

2.8 细胞外基质（ECM）插件新血管形成

小鼠皮下注射9 mg/mL reduced-growth factor细胞外基质（ECM；Cultrex；R&D Systems，Minneapolis，MN，USA） containing 400 ng/mL FGF-2（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）和50 U肝素，在体温下形成固体插件。14天后，取出插件，在0.5 mL细胞裂解缓冲液中匀浆，并在4°C以6000 g离心30分钟。使用比色法测定（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）在400 nm波长检测上清液中的血红蛋白。

2.9 内皮细胞三维管形成 assay

人脐静脉内皮细胞（HUVEC；1×10⁴ cells；Lonza，Basel，Basel-Stadt，Switzerland）接种在96孔板上， containing reduced-growth factor ECM（Cultrex；R & D Systems，Minneapolis，MN，USA），在37°C和5% CO₂下4小时。 then在与人单核THP-1细胞（2.5×10⁴ cells；ATCC，Manassas，VA，USA；RRID:CVCL_A4CA）共培养后测量HUVEC中的管状结构形成，THP-1细胞已用ApoC3（50 μg/mL；Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）、LPS（50 μg/mL）或ATP（5 mM）在 reduced serum EGM2（Lonza，Switzerland）中预处理30分钟，持续4小时。通过使用ImageJ软件（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA；RRID:SCR_002285）测量分支数量确定管状结构形成。细胞原位固定 with 4%福尔马林，透化用于染色 with 1×PBS containing 0.25% Triton X-100（Sigma-Aldrich；St. Louis，MO，USA），并用 casein封闭。细胞与兔抗血管细胞粘附分子1（VCAM-1，1:500，ab134047；Abcam，Cambridge，MA，USA；RRID:AB_2721053）在室温孵育1小时，并使用Alexa Fluor 488缀合山羊二抗（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；RRID:AB_143165）检测。细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（D1306；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）复染。使用ECLIPSE Ts2-FL倒置显微镜（Nikon，Shinagawa，Tokyo，Japan）捕获荧光图像。VCAM-1阳性管状结构数量由J.M.T和K.J.B确定，两人对治疗组 blinded，最终值计算为他们观察的平均值。

2.10 统计学

除非另有说明，结果表示为mean±SEM。治疗组之间的比较使用非配对t检验或单因素或双因素ANOVA与Tukey比较检验事后分析，视情况而定。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 ApoC3全局缺失降低循环甘油三酯，且独立于LPL活性

血浆脂质评估显示Apoc3^?/?小鼠与Apoc3^+/+小鼠相比甘油三酯水平较低。这些甘油三酯水平的差异是在存在或不存在ApoC3的情况下LPL活性无差异的情况下观察到的。Apoc3^?/?和Apoc3^+/+小鼠之间的总胆固醇水平无差异。

3.2 ApoC3全局缺失减弱体内炎症诱导的外膜新血管形成

为了探索ApoC3在炎症诱导的血管新生中的作用，我们采用了股动脉套管模型，其中在左股动脉周围放置非闭塞性套管。套管放置一天后，Apoc3^+/+小鼠套管股动脉中关键血管新生基因Hif1a（2.6倍）和Vegf1（16.9倍，p<0.05）的mRNA表达与未套管股动脉相比增加。相反，在Apoc3^?/?小鼠的套管动脉中，Hif1a和Vegf1 mRNA表达的 increase与未套管相比不显著（分别增加1.4倍和4.4倍），并且趋势低于Apoc3^+/+套管小鼠（p=0.06）。

关键炎症基因Cd68的mRNA表达增加在Apoc3^+/+小鼠套管股动脉中在手术后一天遵循类似模式，表达与对照相比增加约30倍（p≤0.001）。尽管Cd68表达在Apoc3^?/?小鼠中也升高（套管 vs. 对照动脉约17倍增加），但这种增加不具有统计学意义，并且与Apoc3^+/+套管血管相比更低（p=0.06）。编码NF-κB p65亚基的基因Rela的表达在Apoc3^+/+小鼠套管股动脉中倾向于增加 compared to对照；然而，套管放置未能在Apoc3^?/?小鼠的股动脉中诱导其表达。

21天后，套管放置导致股动脉周围外膜扩张 compared to对照动脉。我们还观察到Apoc3^+/+小鼠套管股动脉周围新血管发育，如CD31⁺染色所示；然而，这种反应在全局ApoC3缺失的小鼠中减弱了约40%。评估外膜α-平滑肌肌动蛋白（SMA）⁺小动脉数量以响应股动脉周围套管放置，以确定是否有 established血管形成。这些在5/7的Apoc3^+/+小鼠和4/7的Apoc3^?/?小鼠中明显，并且Apoc3^?/?小鼠有减少趋势。

总之，这些发现支持ApoC3在促进炎症诱导的新血管形成中的作用。

3.3 ApoC3刺激THP-1单核细胞诱导HUVEC中的管状结构形成和VCAM-1表达

为了研究ApoC3在炎症诱导的血管新生中的作用，我们进行了共培养研究，其中接种在ECM涂层孔上的HUVEC在存在或不存在THP-1细胞和ApoC3的情况下进行管状结构形成。虽然ApoC3在单一培养中和THP-1细胞在共培养中倾向于增加管状结构形成，但只有在HUVEC-THP-1共培养在额外ApoC3存在下进行时，管状结构形成才显著增加（p<0.05）。此外，当用ApoC3预处理的THP-1单核细胞与HUVEC共培养时，VCAM1⁺管状结构数量与用ApoC3处理HUVEC或单独与THP-1单核细胞共培养相比增加（p<0.05）。先前有 suggest ApoC3可以激活NLRP3炎性体；然而，我们没有看到 evidence of this，因为用脂多糖（LPS）和 adenosine三磷酸（ATP）处理时管状结构形成减少，但在LPS和ApoC3存在下则没有。ApoC3可能在炎症性血管新生的背景下参与一个恶性循环，通过促进单核细胞招募，单核细胞产生VEGF以促进 excessive新血管形成。新形成的血管 then facilitate增加巨噬细胞供应到此 site，进一步加剧炎症和血管新生。这种效应在动脉粥样硬化发生背景下很重要，在其初期阶段涉及外膜血管的新血管形成。虽然对血管壁的缺血性损伤可能 initiate斑块新血管形成，但它由炎症驱动的血管新生维持，并有助于加速斑块发展和不稳定。本研究中的发现表明Apoc3缺失显著减少响应炎症的外膜新血管形成，并突出ApoC3作为改善周围血管系统中斑块稳定性的有吸引力靶点。

3.4 ApoC3全局缺失对缺血驱动的新血管形成无影响

为了理解ApoC3在缺血驱动的血管新生中的作用，我们使用了后肢缺血模型，其中左股血管床被结扎和切除，并且缺血肢体的血流返回在14天内定期测量。股血管床的移除通常导致腓肠肌中Hif1a和Vegf1表达增加以响应缺氧。激光多普勒灌注成像显示，在诱导缺血前，Apoc3^+/+和Apoc3^?/?小鼠左右肢之间的血流灌注比相当（1.04±0.02 vs. 1.04±0.06；p>0.05）。

手术结扎和移除股动脉后，Apoc3^+/+和Apoc3^?/?小鼠的血流与非缺血肢相比 equally减少（0.64±0.07 vs. 0.69±0.03；p>0.05）。在21天治疗期间的任何时间点，Apoc3^+/+和Apoc3^?/?小鼠之间的缺血与非缺血肢灌注指数无差异。与这些发现一致，有证据表明Apoc3^+/+和Apoc3^?/?小鼠的腓肠肌中肌纤维再生以响应缺血，通过 centralized核肌纤维百分比增加 measured compared to非缺血肢（p<0.01）。然而，Apoc3^?/?和Apoc3^+/+小鼠之间的再生肌纤维无差异。此外，通过天狼星红染色定量、凋亡基因Bax、血管新生基因Hif1a和Vegf1或促炎基因Ccl2、Il6或Vcam1的mRNA表达测量的纤维化在响应缺血时在Apoc3^+/+或Apoc3^?/?小鼠的腓肠肌中无差异 observed。总之，这些发现表明ApoC3不有助于缺氧驱动的血管新生。

3.5 Apoc3缺失对新血管形成无影响

我们使用体内测定调查了ApoC3对新血管形成的影响，其中含有生长因子的ECM插件皮下注射在股动脉上方以促进新血管生长。在该模型中，Apoc3^?/?小鼠表现出与Apoc3^+/+小鼠相似的ECM插件血管化。

4 讨论

本研究证明（i）Apoc3缺失与炎症诱导的新血管形成减少、血管新生相关基因（Hif1α/Vegf1）和炎症标志物（Rela/Cd68）表达减少相关，以及（ii） preserved生理性缺血驱动的血管新生。这些结果 identify ApoC3作为炎症诱导的血管新生的关键调节因子，为血管疾病提供了潜在的新作用。

本研究证明ApoC3可以诱导炎症驱动的血管新生。本研究的一个关键优势是我们在急性时间点（套管放置后24小时）显示了ApoC3在炎症诱导的血管新生中的作用，如 perivascular Cd68表达增加所证明，伴随Apoc3^+/+小鼠中血管新生标志物Hif1a和Vegf1的mRNA表达显著增加，这在Apoc3^?/?小鼠中缺失。这表明ApoC3负责驱动早期巨噬细胞招募到损伤部位，这导致Apoc3^+/+小鼠在套管放置后21天 sustained血管新生，但Apoc3^?/?小鼠则没有。该通路包括血管内皮细胞上的粘附分子激活，由我们与人细胞的共培养研究证明，其中ApoC3刺激更大的内皮细胞管状结构形成，这与THP-1诱导的VCAM1表达相关。这些结果与先前 reports implicating ApoC3 in巨噬细胞招募 by内皮细胞一致，其中ApoC3被显示通过蛋白激酶-C和NF-κB依赖、脂质独立通路上调内皮细胞VCAM1和细胞间粘附分子1表达。此外，ApoC3已被显示增加THP1单核细胞中NF-κB导向的β1-整合素表达，促进与内皮细胞的粘附。ApoC3最近被显示刺激NLRP3炎性体；然而，我们没有看到 evidence of this，因为用LPS和ATP处理时管状结构形成减少，但在LPS和ApoC3存在下则没有。ApoC3可能在炎症性血管新生的背景下参与一个恶性循环，通过促进单核细胞招募，单核细胞产生VEGF以促进 excessive新血管形成。新形成的血管 then facilitate增加巨噬细胞供应到此 site，进一步加剧炎症和血管新生。这种效应在动脉粥样硬化发生背景下很重要，在其初期阶段涉及外膜血管的新血管形成。虽然对血管壁的缺血性损伤可能 initiate斑块新血管形成，但它由炎症驱动的血管新生维持，并有助于加速斑块发展和不稳定。本研究中的发现表明Apoc3缺失显著减少响应炎症的外膜新血管形成，并突出ApoC3作为改善周围血管系统中斑块稳定性的有吸引力靶点。

尽管在后肢缺血模型中表现出与Apoc3^+/+小鼠相似的较低甘油三酯水平，但Apoc3缺失不影响缺血驱动的血管新生、血流或后肢缺血模型中PAD的血管新生标志物表达。我们认为ApoC3 specifically involved in炎症诱导的血管新生，而不是响应缺血。Apoc3缺失导致炎症条件下股动脉套管植入后Cd68、NF-κB、Hif-1α和Vegf1表达降低，表明ApoC3仅在巨噬细胞浸润存在下影响血管新生。HIF-1α和VEGF是关键缺氧诱导的血管新生调节因子。在低氧下，HIF-1α避免羟基化，易位到细胞核，并与HIF-1β二聚化以激活缺氧反应元件，诱导VEGF表达