乌拉坦麻醉大鼠海马齿状波和尖波涟漪的偏侧化取决于胆碱能张力

本文揭示了乌拉坦麻醉下大鼠海马齿状波（DSs）与尖波涟漪（SPW-Rs）的半球间同步性受胆碱能/副交感神经张力调控的重要机制。研究发现，呼吸节律减缓（副交感张力增高）预示SPW-R簇发作，而低胆碱能状态（如使用阿托品后）会解离SPW-R的半球同步，却促进DSs的同步。研究强调了大脑整体状态与身体节律（如呼吸）对海马记忆巩固相关神经活动的影响，为理解麻醉与自然睡眠状态下的神经活动差异提供了新视角。

　　

1 引言

海马在情景记忆形成中至关重要。有效的记忆巩固在睡眠和休息期间至少部分依赖于海马尖波涟漪（SPW-Rs）和齿状波（DSs）。SPW-Rs是海马CA1区的高振幅、快速（>120 Hz）节律性事件，在此期间，代表清醒经验的神经激活模式在皮质-海马环路中重放。DSs起源于内嗅皮层（EC），在齿状回（DG）的门区明显，也可能与神经集合水平的记忆重放有关。

SPW-Rs和DSs在非快速眼动睡眠（NREM）期间比快速眼动睡眠（REM）期间更频繁。在NREM及类似状态期间，海马胆碱能张力低，θ振荡（3–12 Hz）弱，呼吸缓慢。有趣的是，呼吸与大脑的大范围节律性电生理活动同步，在自然睡眠的小鼠中，SPW-Rs和DSs似乎聚集在呼吸周期的特定相位。此外，SPW-Rs和DSs在半球之间以可变程度同步，但神经和身体状态如何影响这种同步尚不清楚。

最初有报道称，在自然睡眠和休息期间，DSs主要是双侧的。然而，根据我们最近在乌拉坦麻醉大鼠中的观察，DSs最常独立发生在左或右海马。另一方面，SPW-Rs可能更具双侧性。就目前而言，尚不清楚SPW-Rs和DSs在左右海马之间的同步水平如何随神经或身体状态波动，以及乌拉坦等麻醉剂是否影响这一点。

2 方法

为了研究半球间同步性以及海马节律性事件与身体节律的联系，我们在乌拉坦麻醉的成年雄性Sprague-Dawley大鼠中记录了海马局部场电位（LFPs）、心电图（ECG）和呼吸。对于一部分大鼠，我们在记录中途注射阿托品（50 mg/kg, i.p.）以降低胆碱能和副交感张力。我们还在一组自由活动的成年雌性大鼠的自然睡眠和清醒休息期间进行了LFP记录，以比较与乌拉坦麻醉期间观察到的SPW-Rs和DSs的半球间同步水平。

所有分析均使用MATLAB和自定义脚本离线进行。SPW-Rs、DSs、θ时段、快慢伽马暴发的 timing 均从LFP中提取。事件被定义为双侧：如果一个事件在一个半球（种子）发生，并且在该事件峰值/中心的±50 ms时间窗口内，对侧半球也有一个事件。从线性探针数据中，检查双侧SPW-Rs期间左右海马的相位同步性。SPW-R簇被确定：一个簇由左和/或右海马中至少10个SPW-R组成，最大事件间间隔为30 s。

呼吸和ECG仅从急性乌拉坦麻醉的大鼠记录。呼吸频率根据压电信号峰值的差异（ms）以Hz确定。呼吸相位使用希尔伯特变换和MATLAB中的角度函数从压电信号确定。ECG信号分析R峰，心率根据峰间间隔确定。为了研究呼吸频率对DSs和SPW-Rs偏侧化的影响，根据事件前5秒期间的呼吸频率，将事件分为两类。

使用IBM SPSS、GraphPad Prism和MATLAB进行所有统计分析。使用配对样本t检验进行受试者内比较。使用MATLAB的Circular Statistics Toolbox分析相位偏好。

3 结果

3.1 乌拉坦麻醉下的海马振荡与呼吸的联系程度可变

在乌拉坦麻醉组（n=9）中，心率为363（26）bpm，呼吸频率为1.71（0.13）Hz，总体θ比率为69（7）%。根据圆形统计，在乌拉坦麻醉下，2/9大鼠的SPW-Rs在统计学上显著偏向呼吸的特定相位：一只大鼠偏好吸气相（-1.46 rad），另一只偏好呼气相（0.74 rad）。慢伽马暴发在四只大鼠中统计学显著偏向吸气。快伽马暴发也在四只大鼠中与呼吸锁相，但偏好的呼吸相位更多样。DSs仅在一只大鼠中与吸气相统计学显著相关。总之，海马振荡与呼吸相位相关，但锁相的幅度和确切偏好相位存在大量变异。心脏周期相位与任何研究的海马振荡的发生均无关。

在首先用乌拉坦麻醉然后约3小时记录后注射阿托品（50 mg/kg, i.p.）的组（n=8）中，注射阿托品前后心率和呼吸频率无统计学显著变化。正如预期，θ比率从阿托品注射前的60（18）%显著下降至注射后的44（4）%。注射阿托品前后，SPW-Rs均未在任何大鼠中统计学显著偏向呼吸的特定相位。注射前，慢伽马暴发在三只大鼠中统计学显著偏向吸气；注射后，则没有大鼠如此。注射前，快伽马暴发在五只大鼠中与呼吸锁相；注射后，仍在三只大鼠中与呼吸的可变相位锁相。注射前，DSs在四只大鼠中与呼吸的特定相位统计学显著相关；注射阿托品后，这种联系在所有大鼠中消失。总结而言，与前一小组大鼠类似，在单用乌拉坦以及乌拉坦加阿托品下，海马节律现象与呼吸相位相连，但锁相的幅度和确切偏好相位存在大量变异。

3.2 呼吸频率降低预示SPW-R簇发作，且与乌拉坦麻醉下的胆碱能张力无关

除了呼吸和心脏周期的快速交替相位外，我们认为身体的整体状态可能与海马功能相关。通过肉眼检查数据，我们很快注意到与SPW-Rs发生相关的呼吸频率下降趋势。因此，我们确定了SPW-R簇的开始时间，并得出了该时间点附近呼吸频率和心率的变化。配对样本t检验证实，虽然心率没有变化，但SPW-R簇发作前1分钟测量的呼吸频率到簇开始后立即测量的呼吸频率统计学显著降低。

在约3小时记录后注射阿托品（50 mg/kg, i.p.）的组（n=8）中，7/8大鼠检测到SPW-R簇，并且在阿托品注射前后，SPW-R簇均 preceded by 呼吸频率降低。即，降低的胆碱能张力并未改变呼吸频率与SPW-R发生之间的关系。

3.3 DSs和SPW-Rs的偏侧化在乌拉坦麻醉下随状态变化

除了海马振荡与身体信号的连接外，我们还对DSs和SPW-Rs的半球间同步性及其受胆碱能张力的影响感兴趣。在乌拉坦麻醉的成年雄性大鼠（n=9）中，大多数海马DSs局限于一个半球：平均仅6（2）%的DSs在REM样状态下是双侧的，11（4）%在NREM样状态下是双侧的。根据配对样本t检验，DSs的偏侧化在REM样和NREM样状态之间存在统计学显著差异。相反，SPW-Rs在REM样状态（44 [14] %)和NREM样状态（46 [10] %)下双侧程度相同。

受胆碱能张力波动反映在呼吸中的事实启发，我们还研究了呼吸频率对DSs和SPW-Rs偏侧化的影响。比较慢呼吸期间（低于平均值1.5个SD的速率）双侧DSs的比例与所有其他DSs的比例，未发现统计学显著差异。在九只大鼠中的八只，慢呼吸期间双侧SPW-Rs的比例高于阈值以上呼吸速率期间测量的比例。差异具有统计学显著性。

在另一组首先用乌拉坦麻醉然后注射阿托品（50 mg/kg, i.p.）的大鼠（n=8）中，我们探讨了直接操纵胆碱能张力是否对DSs和SPW-Rs的偏侧化有任何影响。阿托品对SPW-Rs期间左右CA1锥体细胞层LFP的相位同步性没有明显影响。单用乌拉顿时，10（4）%的DSs和58（6）%的SPW-Rs是双侧的。在乌拉坦和阿托品下，相应值分别为15（5）%和37（8）%。配对样本t检验表明，阿托品增加了双侧DSs的比例，并降低了双侧SPW-Rs的比例。

总结而言，起源于EC的DSs在海马θ比率低（NREM样状态）时比高（REM样状态）时更常是双侧的。SPW-Rs在慢呼吸期间比在较快呼吸期间更常是双侧的。低胆碱能张力和阿托品引起的副交感效应抑制增加了双侧DSs的比例，降低了双侧SPW-Rs的比例。在双侧SPW-Rs期间，sharp waves在半球之间持续相位同步，而ripples则不同，并且在进行中的大脑或身体状态 based on 的比较中，相位同步性没有明显差异。

3.4 DSs和SPW-Rs在清醒休息和自然睡眠中大多是双侧的

为了确认乌拉坦麻醉是否是DSs低半球间同步性的主要来源，我们分析了从慢性植入背侧海马的单极电极获得的LFP数据。总共六只大鼠被记录，三只电极双侧放置在CA1，五只放置在DG/门区。每只大鼠最多使用四次约2小时的记录进行分析。使用检测到事件较少的一侧半球作为种子，我们发现 during awake rest or sleep，60（9）%的SPW-Rs是双侧的，60（14）%的DSs是双侧的。

4 讨论

我们研究了乌拉坦麻醉大鼠海马电生理振荡的发生与呼吸、心跳和胆碱能张力的关系。正如预期，呼吸相位与SPW-Rs、伽马振荡暴发和DSs相关。然而，存在相当大的个体间变异，并且阿托品减弱了这种联系。我们发现心脏周期相位与海马振荡之间没有一致的联系。呼吸频率降低预示SPW-R簇发作，无论是在单用乌拉坦还是乌拉坦加阿托品下，而我们发现心率与SPW-Rs发生之间没有联系。与早期发现一致，DSs大多是单侧的，而在乌拉坦麻醉下，SPW-Rs大约一半时间是双侧的。DSs的半球间同步性在NREM样状态和阿托品影响下更高，而SPW-Rs则相反。一致地，暗示高副交感驱动的慢呼吸与SPW-Rs的半球同步性增加相关。在清醒休息或自然睡眠中，约60%的SPW-Rs和DSs是双侧的。这些结果共同表明整体大脑和身体状态之间存在联系，并且呼吸与被认为在休息和睡眠期间支持记忆巩固的海马电生理事件之间存在特定联系。最后，我们的结果突出了乌拉坦麻醉与自然休息/睡眠之间大脑电生理学的差异。

我们的结果表明，海马振荡可能与乌拉坦麻醉大鼠的呼吸同步，但存在相当大的个体间变异。此外，我们发现心脏周期相位与海马振荡之间没有联系。在头部固定、自然睡眠的小鼠中，有报道称大多数海马DG和CA1锥体细胞放电，并且大多数DSs和SPW-Rs发生在吸气后。有可能呼吸周期相位与大脑功能之间的联系是物种特异性的，并不能在小鼠和大鼠之间推广。另一种可能性是我们当前研究中乌拉坦的使用可能减弱了呼吸与海马活动之间的联系。

然而，动物的整体状态与海马功能之间似乎存在联系：我们报道了在乌拉坦麻醉下，呼吸频率降低 leading up to SPW-R簇发作。呼吸频率降低与SPW-R簇发作之间的联系未被阿托品废除，阿托品诱导了稳定的NREM样状态，其中SPW-Rs经常发生，并且呼吸频率的整体变化很小。与阿托品的已知效应一致，据报道，在NREM期间内源性胆碱能信号减少时，小鼠的SPW-Rs数量增加。此外，乌拉坦麻醉大鼠REM样和NREM样状态之间的交替分别与呼吸频率的增加和减少相关。总之，似乎影响呼吸频率的胆碱能或副交感张力的变化也可能影响SPW-Rs的发生。呼吸频率与海马振荡之间是否存在因果关系仍有待研究。我们当前的观察确实提示调节呼吸频率可能提供一种操纵与记忆巩固相关的大脑活动的方法。

测试上述想法的一种方法是直接操纵前包钦格复合体（preB?tC）起搏细胞的活动：preB?tC神经元的放电启动吸气，激活交感神经输出，并抑制副交感输出。preB?tC神经元接收来自下丘脑室旁核（PVN）的输入，该核通过下丘脑-垂体-肾上腺轴控制 feeding 和应激反应。有趣的是，PVN也与海马相连。此外，PVN接收来自丘脑室旁核（PVT）的输入，该核也投射到海马（和内侧前额叶皮层）。相反，preB?tC神经元本身仅向前脑发送稀疏的传出连接，甚至这些连接也仅限于丘脑和下丘脑的核团。然而，它们确实密集投射到参与呼吸控制的其他脑干区域，包括延髓的旁舌下区域和孤束核（NTS）。NTS与PVN相连，并与蓝斑（LC）相连，后者然后连接到海马以促进学习。事实上，在SPW-Rs期间电刺激LC或训练后药理学操纵去甲肾上腺素活性（从而影响SPW-Rs）都会阻碍学习。总结而言，虽然尚无preB?tC与海马之间直接解剖联系的报道，但上述各种间接双向连接可能有助于解释呼吸如何与海马活动联系起来。显然，需要更多研究来识别呼吸与前脑功能之间联系的机制。

先前在乌拉坦麻醉大鼠中的研究报道了CA1 LFP的高双侧同步性，但DG事件的同步性较低。在我们当前来自乌拉坦麻醉大鼠的数据中，大约一半时间SPW-Rs在50 ms内同时在两个海马检测到。SPW-Rs的双侧比例在清醒休息或睡眠期间相似。总体而言，我们当前研究中在乌拉坦麻醉和自然休息或睡眠下SPW-Rs的双侧比例似乎高于先前在Sprague-Dawley大鼠自然睡眠中报道的比例，但与小鼠中报道的比例相似。阿托品显著降低了我们乌拉坦麻醉大鼠中双侧SPW-Rs的比例。一致地，暗示NREM样状态下高副交感驱动的慢呼吸与大多数大鼠中SPW-Rs的半球同步性增加相关。我们关于相位同步性的结果表明sharp waves的双侧同步性显著，而ripples则不同。这与早期发现一致：SPW-Rs的发生与全脑活动模式相关，并且EC似乎控制SPW-R生成。然而，锥体细胞放电模式假定起源于CA3。

与SPW-Rs相反，乌拉坦麻醉期间的DSs几乎总是单侧的，但在无麻醉下，其双侧程度与SPW-Rs相似。因此，似乎乌拉坦 dissociates 来自左右EC到相应海马的输入。这与先前关于乌拉坦麻醉大鼠左右新皮质去同步化的报道一致，特别是涉及S1区域在NREM样状态期间的高频活动。假定来自EC到DG responsible for DSs的输入通过穿通路径到达，这是一个主要单侧靶向的路径。在双侧DSs期间，来自左右EC的信号需要同时发送，或者单侧EC信号需要通过穿通路径或间接通过关联路径或海马连合到达对侧DG，两者都起源于门区。有趣的是，在NREM样状态和阿托品下，DSs在乌拉坦麻醉大鼠中更常是双侧的（尽管仍然大多是单侧的）。这可能反映了左右EC活动的同步或对侧连接到DG的增强，或两者兼而有之。需要进一步研究以确定除了胆碱能信号之外还有什么其他因素调节半球间同步。更重要的是，在未来的研究中，需要考虑乌拉坦对大脑网络活动和连接的影响。

总结而言，胆碱能张力似乎对左右DG（DSs）的同步与左右CA1（SPW-Rs）的同步有不同的影响。显然，在未来的研究中，应优先选择双侧记录 over 单侧记录以捕捉海马活动的全貌，因为相当大比例的事件可能是单侧的。SPW-Rs和DSs的偏侧化如何与海马记忆形成联系起来仍有待观察。