综述：线粒体Ca2+在癌症生长和代谢中的作用

本综述深入探讨了线粒体Ca2+稳态在癌症代谢重编程中的核心作用，系统阐述了其通过调控TCA循环、ETC及ROS生成影响肿瘤生长与存活的机制，并展望了靶向MCU复合体等关键通道（如MCU、MICU1、NCLX）的癌症治疗新策略。

　　

2 线粒体作为细胞器

线粒体是真核细胞中具有双层膜结构的细胞器，由外膜（OMM）和内膜（IMM）包裹基质构成。高度内褶的IMM形成嵴结构，其上分布着呼吸链复合体。线粒体拥有自身的DNA（mtDNA），以环状染色体形式编码氧化磷酸化（OXPHOS）所需的多肽以及转移RNA和核糖体RNA。由于其独特的双膜结构和系统发育分析，线粒体被认为起源于内共生蛋白酶菌。线粒体通常通过母系遗传，因此mtDNA突变导致的线粒体疾病通过母系传递。线粒体网络处于动态变化中，通过分裂、融合、线粒体自噬和生物发生来调节功能并应对压力。线粒体的形态多样，从大型、相互连接到狭窄、细长，嵴的数量也各异，这些结构差异与代谢功能和营养可用性的改变密切相关。高度网络化的线粒体在缺氧环境中支持ATP生成，而碎片化的线粒体则与应激反应和营养充足条件相关。更多的嵴能提高线粒体效率。值得注意的是，这些变化不仅与营养可用性有关，也受Ca²⁺信号的影响。例如，与细胞信号传导相关的胞质Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）升高可能促进线粒体分裂。这种动态变化在癌细胞中被认为至关重要，使其能够快速适应不断变化的条件和压力以促进生存。

3 线粒体代谢

线粒体通常因其在ATP合成中的关键作用而被视为细胞内主要的动力源。线粒体还显著贡献于生物合成中间体的生产，这些中间体是蛋白质、脂质和核苷酸合成所必需的，对于细胞生长和分裂至关重要。由于癌细胞生长和分裂更快，需要合成更多的膜、RNA、DNA和蛋白质，这些中间体的生产可能比在正常细胞中更为重要。葡萄糖、脂肪酸和谷氨酰胺在线粒体中的分解支持通过TCA循环的生物化学中间体通量，TCA循环是细胞处理源自碳水化合物和脂质代谢的乙酰辅酶A（Ac-CoA）的主要途径，以NADH和FADH₂的形式向电子传递链（ETC）提供电子等效物，最终用于制造ATP，并在此过程中产生活性氧（ROS）。TCA循环能够自我再生，其中间体也可以通过回补反应（anaplerosis）根据需要补充。所有这些过程都以某种方式受Ca²⁺信号传导的调节。

4 Ca²⁺信号向线粒体的转导

Ca²⁺作为细胞中关键的第二信使，调节多种酶、转录因子和离子通道，这些对于细胞生长、代谢和存活是必需的。[Ca²⁺]_i受到高度调控，浓度通常维持在一个设定范围内。当[Ca²⁺]_i偏离这些可接受范围时，可能会限制细胞功能、分裂和/或存活。基础[Ca²⁺]_i维持在约100 nM，而细胞外[Ca²⁺]通常为1-4 mM。细胞通过主动将Ca²⁺挤出质膜和主动 sequestration 到肌/内质网（ER）中来维持低[Ca²⁺]_i，ER是主要的细胞内Ca²⁺储存细胞器。ER腔内游离[Ca²⁺]通常在100-1000 μM范围内，总Ca²⁺含量甚至更高，因为腔内Ca²⁺结合蛋白会大量 sequestration。同样，线粒体基质[Ca²⁺]（[Ca²⁺]_m）也受到高度调控，静息[Ca²⁺]_m通常维持在约100-500 nM。重要的是，[Ca²⁺]_i信号可以传递到线粒体，使[Ca²⁺]_m升高到更高水平，并产生重要的功能效应。

细胞外环境与细胞质之间以及ER腔与细胞质之间巨大的Ca²⁺电化学梯度使得这些膜中Ca²⁺渗透性的激活能够引起[Ca²⁺]_i的快速变化，因为Ca²⁺沿着这些梯度移动。[Ca²⁺]_i信号可以通过Ca²⁺可透性质膜离子通道的打开或通过细胞内储存（主要是ER）中Ca²⁺的释放（通过Ca²⁺释放离子通道）来激活。ER依赖性Ca²⁺信号传导可以在质膜中的RTKs和Gαq偶联的G蛋白偶联受体（GPCRs）受到细胞外信号刺激时被激活。由此产生的受体构象变化可能偶联到磷脂酶C（PLC）的激活。PLC的构象变化催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）水解为二酰基甘油（DAG）和肌醇-1,4,5-三磷酸（IP₃）。IP₃在细胞质中扩散并与IP₃受体（IP₃R）结合，IP₃R是一种ER驻留的Ca²⁺可渗透离子通道，激活它以使ER Ca²⁺释放到细胞质中。升高的[Ca²⁺]_i可以被细胞质效应器感知，并转移到包括细胞核、溶酶体和线粒体在内的细胞器。受体激活的[Ca²⁺]_i信号可以是高度局域化的，也可以在整个细胞中传播，可以是瞬态的或持续的，并且在时间上以振荡或尖峰的形式变化。导致[Ca²⁺]_ER降低的持续激活可以导致储存操作的Ca²⁺进入（SOCE）的激活，其中ER定位的STIM（基质相互作用分子）Ca²⁺传感器和质膜ORAI（Ca²⁺释放激活的钙通道）Ca²⁺通道合作以维持[Ca²⁺]_i信号并在刺激终止时补充ER储存，为未来的信号传导轮次做准备。

5 Ca²⁺在线粒体膜上的流动

线粒体是Ca²⁺信号传导的主要目标。线粒体含有许多Ca²⁺响应酶，并且已知在许多细胞环境中具有作为Ca²⁺缓冲剂的能力，包括在肌肉和免疫细胞中。[Ca²⁺]_m受到Ca²⁺可渗透离子通道和转运蛋白及其调节剂的活性、表达、定位、稳定性和翻译后修饰的高度调控。足够强度和动力学的[Ca²⁺]_i信号可以传播到线粒体中，部分受线粒体与[Ca²⁺]_i升高区域的空间接近度的调节。在ER和线粒体紧密相对的线粒体相关膜接触位点（MAMs）区域，局部高[Ca²⁺]_i提供了一种实现ER到线粒体Ca²⁺转移的机制，将受体介导的细胞信号传导与线粒体功能联系起来。

5.1 线粒体Ca²⁺摄取

线粒体Ca²⁺从细胞质摄取到基质中涉及Ca²⁺跨越两个膜的转运。通常认为，含有VDAC的OMM对Ca²⁺渗透到膜间间隙（IMS）不构成显著屏障，而IMM的渗透性明显较低。大的IMM膜电压（约-160 mV，基质侧带负电）为Ca²⁺进入基质提供了强大的热力学驱动力。Ca²⁺进入基质的主要方式是线粒体Ca²⁺单向转运体（MCU）离子通道复合体。我们对这个复合体的理解严重依赖于遗传（即敲低、敲除和重新或过表达实验）和药理学实验，这些实验在一定程度上受到药理学研究不足的阻碍。虽然这个复合体的药理学传统上基于非选择性的钌基化合物（如Ru360），但最近通过高通量筛选已经鉴定出更针对性的该复合体抑制剂。

这个高度保守的复合体由成孔亚基MCU、支架蛋白必需MCU调节剂（EMRE）以及IMS定位的MICU 1、2和3蛋白组成。它受到MCU调节剂1（MCUR1）的正向调节，并受到MCUb（一种替代的成孔亚基）的负向调节。MICU蛋白作为二聚体存在，通常由MICU1与自身或与MICU2结合，在某些组织中与MICU3结合。MICU蛋白是含有EF手的Ca²⁺结合蛋白，通过与MCU和EMRE结合与四聚体MCU孔相关联。在它们的载脂状态下，MICU1阻塞MCU孔的入口，使通道和IMM对Ca²⁺不渗透。Ca²⁺与MICU蛋白结合诱导构象变化，导致孔道解除阻塞，使得Ca²⁺能够通过MCU渗透到基质中，这个过程被称为“门控”。MICU的Ca²⁺亲和力确保孔道保持阻塞，直到[Ca²⁺]_i达到1-2 μM，这些浓度在[Ca²⁺]_i信号传导期间通常在 bulk cytoplasm 中无法达到，但在靠近Ca²⁺源的区域存在，最显著的是在ER-线粒体接触位点。在没有MICU1的情况下，门控被废除，Ca²⁺自由地通过MCU流动，导致线粒体Ca²⁺超载，带来有害后果。

由于IP₃R和MCU复合体的普遍表达，以及由这些离子通道介导的ER到线粒体Ca²⁺转移在细胞生物能量学中的重要作用，令人惊讶的是，在全身性小鼠敲除模型中，成孔亚基MCU的基因缺失只有很少的明显影响，幼崽能够存活到出生。MCU敲除小鼠的体型略小于野生型小鼠，并且观察到一些运动不耐受。相比之下，在近交系品系中产生的MCU缺失模型不可存活，尽管导致这种差异反应的机制目前尚不清楚。MCU缺失的细胞模型具有功能性呼吸作用，能够生长和增殖，尽管这些复杂的表型通常与正常型对照相比有所降低。值得注意的是，在缺乏MCU的线粒体中存在Ca²⁺，尽管这些细胞缺乏对线粒体外Ca²⁺的快速摄取反应。这些发现可能表明了一种尚未描述的Ca²⁺进入线粒体的模式，也许是通过Ca²⁺外排机制的反向流动。

5.2 线粒体Ca²⁺外排

几种蛋白质被认为有助于线粒体Ca²⁺外排。最确定的是Na⁺/Li⁺/Ca²⁺交换体（NCLX，由SLC8B1基因编码），它以电生性的方式以交换Na⁺或Li⁺来外排Ca²⁺。LETM1（亮氨酸拉链和EF手包含跨膜蛋白1）被描述为一种IMM驻留的Ca²⁺/H⁺反向转运体，对ATP生产有影响，尽管也有人认为LETM1可能通过调节嵴形态来间接调节Ca²⁺外排。生长激素诱导跨膜蛋白（GHITM，也称为TMBIM5）与LETM1相互作用，已被鉴定为一种IMM跨膜蛋白，可能通过Ca²⁺/H⁺反向转运体活性调节线粒体Ca²⁺水平，并对代谢产生下游影响。在某些情况下，线粒体Ca²⁺外排可能通过线粒体通透性转换孔（mPTP）的“闪烁”作用发生。这与mPTP在压力下的典型行为形成对比，在压力下它被认为保持开放并促进细胞死亡。mPTP的分子组成了解甚少。包括ATP合酶、腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）和亲环蛋白D在内的蛋白质被认为是复合体的组成部分或调节剂。虽然这些线粒体Ca²⁺外排途径通常被表征，但该领域的许多工作是在正常型细胞的背景下进行的，特别是在心肌细胞中。这可能会限制在其他背景下的发现解释，例如在癌症中，由于突变谱、表观遗传变化和下游表达效应的差异，典型的细胞功能通常与从“正常”细胞和其他细胞类型预期的不同。为了确保这些途径在癌症背景下以相同的方式工作，需要进行更多的工作。

5.3 线粒体Ca²⁺缓冲

在线粒体基质内，Ca²⁺被无机磷酸盐的存在 heavily buffered。实际上，结合态与游离态Ca²⁺的比例可能高达100,000:1。这种高缓冲能力有时会影响[Ca²⁺]_i信号，并维持[Ca²⁺]_m在足以促进代谢活动但又低到足以防止细胞应激反应、去极化和mPTP开放的水平。线粒体Ca²⁺对细胞质信号的缓冲受信号幅度、频率和线粒体pH的影响，导致组织特异性的行为差异。关于线粒体Ca²⁺缓冲在癌症背景下的研究很少。因此，尚不清楚癌细胞是否比其正常型对应物具有更高的线粒体Ca²⁺缓冲能力。然而，线粒体内的磷酸盐缓冲可能有助于癌症以及正常细胞中的Ca²⁺处理，因此它也可能在细胞可能暴露于意外高[Ca²⁺]_i的情况下（例如当用离子霉素处理时）有助于Ca²⁺处理和细胞存活。

6 线粒体代谢与Ca²⁺

最近的研究确定了线粒体代谢与Ca²⁺信号传导之间存在密切的相互关系。Ca²⁺可以直接和间接影响底物输送、TCA循环进入、TCA循环通量、电子传递链（ETC）活性和ROS生成，对代谢和细胞生理学具有下游影响。

6.1 底物进入TCA循环

底物进入TCA循环受线粒体Ca²⁺水平的调节。丙酮酸是线粒体代谢的主要底物之一。葡萄糖通过糖酵解初步分解为丙酮酸发生在细胞质中，尽管丙酮酸也可以通过其他次级途径由氨基酸、乳酸和苹果酸形成，然后通过线粒体丙酮酸转运蛋白（MPC1、2和3）进入线粒体基质。这种最近发现的导入途径的调控尚不清楚。MPC1表达在前列腺癌中受到抑制，这与糖酵解、生长和侵袭能力增加有关。这些发现与癌细胞中有氧糖酵解增加一致。值得注意的是，MPC抑制增加了Ca²⁺调节蛋白MICU1的表达，并减少了正常肝细胞中的线粒体Ca²⁺摄取，表明转运蛋白活性与IMM处的Ca²⁺信号传导之间存在联系。

在线粒体基质内，丙酮酸可以被丙酮酸脱氢酶（PDH）脱氢形成乙酰辅酶A（Ac-CoA），或者它可以通过丙酮酸羧化酶（PC）进入TCA循环，PC将其转化为草酰乙酸，这是TCA循环的中间体。[Ca²⁺]_m通过刺激PDH磷酸酶的活性以去除PDH的E1α亚基上多个位点的抑制性磷酸化，从而深刻调节PDH活性。通过解除对PDH的抑制，线粒体Ca²⁺刺激丙酮酸转化为Ac-CoA，增强TCA循环的通量。另一种可以催化丙酮酸进入TCA循环的酶，PC，可能促进代谢可塑性和细胞韧性以及癌细胞的转移，特别是在谷氨酰胺限制的情况下，可能通过对脂质代谢和氧化应激反应的影响。PC活性需要Mg²⁺的存在，并受Ac-CoA浓度的调节，也受[Ca²⁺]_m的调节，可能通过对PDH的影响间接起作用。确实，在完整细胞中，改变的Ca²⁺浓度对PC功能的调节作用比在分离制备中更强，这支持了间接机制的观点。

脂质通过脂肪酸氧化（FAO）为TCA循环提供另一种燃料，在FAO中，2碳单元逐渐从脂肪酸中移除在线粒体基质中生成Ac-CoA。在某些脂质依赖性癌症中，FAO对于细胞生长和存活至关重要，对于治疗开发具有重大意义。我们对线粒体Ca²⁺稳态与FAO之间关系的理解大多来自肌肉组织的研究。在肌肉中，通过MCU的线粒体Ca²⁺流入在葡萄糖水平受限时增加FAO。当小鼠肌肉中的MCU被敲除时，收缩力和跑步能力会降低，但并非 dramatically impaired，这归因于FAO的增加。脂肪酸摄取和FAO的抑制在乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤和胃肠道癌等临床前研究中显示出前景，但线粒体Ca²⁺与FAO的关系在癌细胞中尚未得到表征。

谷氨酰胺是TCA循环的另一个主要碳源，特别是在癌细胞中。实际上，许多癌症被描述为“谷氨酰胺 addicted”，并且对这种底物有代谢偏好。谷氨酰胺首先被谷氨酰胺酶（GLS）脱氨，GLS是一种线粒体驻留蛋白，产生氨和谷氨酸，然后谷氨酸被谷氨酸脱氢酶（GDH）脱氨产生α-酮戊二酸（αKG）。目前尚不清楚GLS是面向外还是面向内位于IMM上，表明谷氨酰胺的线粒体代谢可能需要谷氨酰胺或谷氨酸转运蛋白，其身份仍然未知。目前尚未表征细胞质或线粒体Ca²⁺对GLS的影响，尽管据报道Ca²⁺在芽孢杆菌和拟南芥中刺激GDH功能。有趣的是，一项针对GDH抑制剂的高通量筛选发现了多种Ca²⁺调节剂，包括一种Ca²⁺通道阻滞剂和一种钙调蛋白拮抗剂，表明GDH功能可能受到上游Ca²⁺变化的密切调节，尽管可能涉及的区室目前尚未表征。虽然存在谷氨酰胺代谢抑制剂，但它们对线粒体Ca²⁺信号传导的影响在mPTP背景之外了解甚少。其中一种抑制剂，L-DON（6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸），诱导mPTP，增强了由纳米颗粒共同递送的碳酸钙引起的Ca²⁺超载。

除了谷氨酰胺，其他氨基酸也可能在改变的线粒体Ca²⁺稳态背景下影响细胞代谢。胱氨酸已被确定为缺乏MCU的胰腺癌细胞中关键的、可靶向的代谢脆弱性。丝氨酸、天冬酰胺和其他氨基酸的代谢依赖性已在多种不同癌症类型中报道，当线粒体Ca²⁺通量改变时，这些依赖性可能存在或加剧。然而，该领域的工作很少，并且可能预期组织特异性效应。

6.2 TCA循环通量

虽然PDH被认为是乙酰辅酶A的看门人，并且是葡萄糖碳通过TCA循环通量的限速步骤，但该循环也受到高度内部调节。这种调节可以通过酶蛋白池的改变、翻译后修饰和[Ca²⁺]_m发生。值得注意的是，增加[Ca²⁺]_m降低了异柠檬酸脱氢酶（IDH）和αKG脱氢酶（αKGDH）的米氏常数（K_m）。在IDH中，高[Ca²⁺]增加了异柠檬酸转化为αKG和CO₂的转化。ATP/ADP比率对Ca²⁺敏感性的影响在IDH中比在αKGDH或PDH中更 profound，提供了额外的调节层，其中线粒体Ca²⁺流入可能在低能量条件（高ADP，低ATP）下更强地刺激IDH，以促进ETC的下游作用。在IDH下游，αKGDH将αKG转化为琥珀酰辅酶A，在此过程中将NAD⁺转化为NADH。增加的[Ca²⁺]_m以与IDH中观察到的类似方式降低αKGDH的K_m，尽管αKGDH对NADH/NAD⁺和琥珀酰辅酶A/CoA比率比ATP/ADP比率更敏感。因此，IDH似乎在能量池低且[Ca²⁺]_m高时“开启”，而αKGDH活性响应于[Ca²⁺]_m的增加而增加，但在αKGDH下游产物积累的条件下充当“刹车”。虽然该循环中的其他蛋白质不被认为是Ca²⁺敏感的，但它们受底物和产物浓度的调节，而这些浓度又通过Ca²⁺依赖性脱氢酶PDH、IDH和αKGDH的调节而改变。因此，TCA循环通量以及潜在的代谢物池响应于Ca²⁺流入线粒体基质而增加。

6.3 电子传递链

线粒体对于ATP的产生至关重要，ATP用于驱动许多生物过程。氧化磷酸化（OXPHOS）在线粒体中进行，每分子葡萄糖产生的ATP是单独糖酵解的15倍。OXPHOS依赖TCA循环向ETC提供还原当量，以创建驱动ATP合酶的质子动力。ATP可用性对所有细胞都至关重要，并且在运动或分泌细胞中可能具有特殊重要性，因为这些过程是ATP驱动的。重要的是，这些过程可能在癌细胞中上调，特别是那些 engaged in active metastasis 的细胞。

Ca²⁺和ETC功能紧密相关。ETC功能通过增加IMM的负膜电位促进Ca²⁺流入。反过来，高[Ca²⁺]_m刺激TCA循环为ETC提供底物。通过敲低NDUFAF3（NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合体组装因子3）和SDHB（琥珀酸脱氢酶铁硫亚基B）来降低ETC的功能性，会减少Ca²⁺流入和流出，与线粒体膜电位无关。类似地，在正常小鼠胰腺β细胞中，复合体III的敲低改变了氧化还原状态，并减少了葡萄糖刺激下游的Ca²⁺信号。Ca²⁺也可能通过对离子平衡、底物可用性、磷酸化和转录调节的影响影响F₁F₀ ATPase（复合体V，ATP合酶）的功能。

6.4 活性氧物种

ROS由导致能量产生的代谢过程产生，包括TCA循环（特别是在αKG转化为琥珀酰辅酶A期间）和ETC。Ca²⁺信号传导和ROS密切相关。虽然高[Ca²⁺]_m增加了这些代谢途径的通量，但ROS可以通过改变代谢和Ca²⁺处理引起这些途径功能的改变。一些研究表明，在这些情况下观察到的ROS增加可能是由于线粒体膜电位的改变。在分离的线粒体中，高[Ca²⁺]_m可导致线粒体通透性转换孔（mPTP）的打开和ROS生成的快速增加。抗氧化剂处理抑制mPTP打开，并可能在某些背景下降低Ca²⁺水平， potentially reducing toxicity。另一方面，Ca²⁺信号传导可以在某些组织和背景下减少ROS信号传导，例如在分离的脑线粒体和高膜电位的情况下。这些发现表明，在这里，Ca²⁺信号传导也可以在调节中扮演多重角色，具有巨大的组织和背景特异性潜力。

7 癌症中的线粒体Ca²⁺

鉴于Ca²⁺在细胞质中的蛋白质调节、代谢和信号通路中的重要性众所周知，并且这些信号到线粒体的高度动态调节，线粒体Ca²⁺稳态可以显著影响癌症的发展、生长和存活也就不足为奇了。确实，许多研究显示了线粒体中Ca²⁺调节和受Ca²⁺调节的蛋白质与癌症相关表型之间的联系。重要的是，