高氧应激后少突胶质前体细胞分泌组的性别特异性差异及其对神经元存活的影响机制研究

本研究发现，在高氧应激条件下，雌雄来源的小鼠少突胶质前体细胞（OPCs）分泌组存在显著性别差异，仅有6%的蛋白存在重叠。雌性细胞通过特异性上调FGF-2（成纤维细胞生长因子2）等保护性因子增强神经元存活能力，而雄性细胞则倾向于分泌更多线粒体相关蛋白，可能触发神经炎症反应。该研究为解释早产儿脑白质损伤的性别差异性提供了关键分子机制，并为性别特异性神经保护策略的开发奠定了理论基础。

　　

1 引言

中枢神经系统（CNS）中不同细胞类型间的有效通讯对神经发育、维持和再生过程至关重要。这种细胞间通讯通过分泌因子实现，包括自由分泌的蛋白质和包裹在细胞外囊泡（EVs）中的蛋白质。少突胶质细胞在脑发育过程中通过产生大量髓鞘膜包裹轴突，提供营养支持和电绝缘保障。成熟少突胶质细胞已知会释放EVs，并被神经元摄取发挥神经保护作用。然而，关于发育过程中少突胶质前体细胞（OPCs）的EV分泌知之甚少。

早产儿大脑发育早期阶段，氧化应激损伤（尤其是新生儿重症监护中常用的高氧治疗）对发育中大脑产生巨大影响，是导致早产儿脑白质损伤的主要因素。临床研究明确显示，男性性别是神经系统不良结局的主要风险因素。我们前期研究发现原代小鼠OPCs对氧化应激的反应存在显著的性别差异，因此提出这些性别差异可能也存在于细胞外信号传导中。

2 结果

2.1 雌雄小鼠OPCs蛋白质谱比较

对高氧（80% O₂）处理24小时的雌雄来源原代小鼠OPCs培养上清液进行分泌组分析，显示显著的性别特异性蛋白特征，高氧条件下两性间仅有6%的重叠。雄性细胞在高氧应激下分泌更高比例的线粒体蛋白。在高氧处理组特异性因子中，FGF-2在雌性上清液中含量显著更高。对神经元细胞（雄性）的功能实验显示，用雌性高氧OPCs上清处理可增加神经元存活率，这可能归因于FGF-2水平升高。

初始分析显示，在大多数检测到的蛋白质中，雌雄上清液水平无显著差异。在总鉴定蛋白中，比较组中强度显著不同的蛋白质数量较少（3%），常氧（105个蛋白）和高氧（104个蛋白）条件下相似。令人惊讶的是，两种比较中鉴定的蛋白质重叠很少，功能重叠也很少。进一步功能分析显示，高氧条件下差异丰富蛋白中富含细胞内蛋白运输、神经变性和多种疾病通路。

性染色体编码基因对观察到的差异贡献分析显示，常氧条件下6.6%的显著不同蛋白与性染色体相关，而高氧后无一性连锁蛋白在雌雄间显著不同。因此，高氧处理减少了X连锁差异蛋白水平，但同时发生其他性别特异性改变。

2.2 高氧改变雌雄OPCs分泌组谱

高氧对分泌组的影响（雄性5.9%，雌性6.3%）强于性别特异性差异（3%）。尽管雌雄间显著改变的蛋白重叠很少，但考虑多种本体术语时观察到较高的功能重叠。Metascape功能分析揭示了反应相关通路和生物过程。

雌性组高氧后功能富集包括小分子分解代谢过程和蛋白质成熟，而雄性组改变蛋白富集于翻译后蛋白磷酸化、前体代谢物和能量生成以及线粒体蛋白降解。高氧的总体效应是两性细胞分泌组中大量蛋白水平降低（雄性所有显著改变蛋白的76.5%，雌性57.9%）。然而，雌性分泌组中高氧后丰度增加的蛋白比例（42%）高于雄性（23.4%）。雌性分泌组响应高氧调节的X染色体连锁蛋白数量略多。

为排除细胞死亡和裂解对观察到的分泌组中线粒体蛋白的贡献，进行了一系列补充实验，包括切割 caspase-3免疫染色流式细胞术、活性caspase 3抗体Western blot、相差显微镜、LDH释放和XTT实验。结果表明24小时高氧处理后无细胞死亡、广泛凋亡或细胞毒性迹象。XTT实验显示高氧后雌雄细胞代谢活性显著降低，表明代谢应激但不一定是细胞死亡。

2.3 高氧处理后雌雄分泌组ON/OFF靶点广泛不同

分析仅存在于常氧或高氧条件下的蛋白质（ON/OFF靶点），发现脑特异性丝氨酸蛋白酶4（BSSP-4）（Prss22）在雌雄分泌组中仅存在于常氧条件。相反，神经分泌蛋白VGF（Vgf）和浆脂蛋白（质膜蛋白脂质）（Pllp）仅在雌性分泌组常氧条件下鉴定到。

高氧触发雌雄细胞分泌不同蛋白质。雌性细胞分泌成纤维细胞生长因子2（FGF-2），该蛋白参与大量分子通路和细胞功能，包括胶质细胞分化和对轴突损伤的反应。其他蛋白包括液泡蛋白分选相关蛋白37C（Vps37c）、芳烃受体核转位子2（Arnt2）、细胞外组蛋白H1.1（H1a）和双磷酸甘油酸变位酶（Bpgm）。因此，雌性OPCs表现出对氧化应激的主动保护反应，特征为神经营养支持（FGF-2、VGF）、有效囊泡运输（Vps37c、H1a）、代谢适应（Bpgm）和应激信号调节（Arnt2）。常氧下Vgf和Pllp的基线分泌表明雌性OPCs在应激暴露前就维持了稳态优势。

雄性样本中，鉴定到Ras关联域包含蛋白2（Rassf2）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1（Gnai1）以及E3泛素蛋白连接酶ARIH2，和多聚谷氨酰胺结合蛋白1（Pqbp1）（已知与神经退行性疾病和脑炎症相关）。此外，仅在高氧后雄性细胞上清中存在与神经变性相关的错配样激酶1（Mink1）。与儿科脑病、神经变性和炎症相关的蛋白存在表明雄性OPCs可能更易受氧化应激影响，也提示高氧诱导向促凋亡、炎症和神经变性通路转变。

2.4 雌性高氧处理OPCs上清中的FGF-2提高神经元细胞存活率

尽管FGF-2在雌性OPCs分泌组ON/OFF靶点丰度比较中排名第四，但它是唯一具有"细胞外空间"特定注释的蛋白，是最有希望产生旁分泌效应的候选因子。ELISA检测显示雌性细胞培养上清中FGF-2量显著高于雄性高氧处理上清。

用雌雄OPCs经80% O₂或常氧条件处理24小时后的细胞培养上清处理分化的ReNcell神经元，XTT实验测定上清是否影响神经元细胞存活率。结果表明，用雌性高氧培养基处理可显著增强神经元存活率。为确定观察到的存活增强是否归因于FGF-2，进行XTT实验，用雌性高氧上清结合FGF-2抗体和FGF-2抑制剂处理神经元细胞。结果显示，FGF-2抗体或FGF-2抑制剂处理均显著降低神经元细胞存活率，添加含FGF-2培养基后可恢复。

2.5 雌性高氧处理上清治疗导致与纯FGF-2添加相似的神经元分子调节

对分化的ReNcell神经元进行比较蛋白质组学分析，细胞未经处理作为参考样本，或用雌性高氧或常氧上清或含纯FGF-2培养基处理。目的是观察是否可触发类似的蛋白质组变化和分子调节。主成分1显示对照样本与雌性常氧上清处理样本聚集一侧，FGF-2组和雌性高氧上清处理组聚集另一侧。高氧上清处理组大多数蛋白与FGF-2处理调节方向相同。总体显著蛋白变化与高氧上清处理后观察到的有70%重叠，而与常氧上清孵育仅有40%重叠。

IPA典型通路分析显示，FGF-2和高氧上清处理组间比常氧上清组有更多相似通路。观察通路调节，发现FGF-2和高氧组中上皮粘连接头信号、颗粒酶A信号和SREBF（SREBP）激活基因表达激活，而常氧组中这些通路失活或无调节。另一方面，DNA损伤/端粒应激诱导衰老和淀粉样纤维形成在常氧组激活，另两组中无活性。

观察到所有三组细胞内FGF-2水平增加，但FGFR降低。这可能是由于配体诱导的下调，细胞外和细胞内FGF-2与FGFRs结合导致受体内化和后续降解，防止信号通路过度激活。此外，看到两个Sprouty蛋白（SPRY2和SPRED1）增加，可调节FGFRs活性和下游信号通路。

3 讨论

高氧已知阻碍OPCs成熟，是早产儿脑白质损伤的重要原因。考虑到临床研究积累的证据指出男性性别是独立相关风险因素，男女大脑对高氧损伤的反应可能不同。

扩展我们前期关注细胞内信号的研究，现在揭示了雌雄来源OPCs分泌组在正常条件和高氧反应下的明显差异。这些差异表明雌雄OPCs可能以不同方式与环境及邻近细胞通讯，两性OPCs可能具有应对或减轻氧化损伤的不同机制。

观察性别特异性分泌蛋白模式，明显看到雄性细胞分泌组中的线粒体蛋白更易受高氧影响。分泌的线粒体蛋白被提出具有多种功能，包括参与长程代谢调节、质量控制形式或刺激免疫系统。雄性OPCs中线粒体功能障碍可能导致氧化线粒体内容物分泌，作为损伤相关分子模式（DAMPs）激活邻近细胞类型（如小胶质细胞和星形胶质细胞）的炎症细胞，并触发促炎免疫反应导致未成熟雄性大脑进一步损伤。尽管看到许多线粒体蛋白高氧后在雄性分泌组中丰度降低，但其数量显著高于雌性分泌组。此外，检测到雄性样本高氧后富集的CPT2（肉碱棕榈酰转移酶2）蛋白碳化增加，表明雄性蛋白氧化增加。

雌性分泌组高氧处理后存在FGF-2以及谷氧还蛋白-1（GLRX-1）上调，表明雌性OPCs可能通过旁分泌机制增强局部微环境细胞的抗氧化能力和促进修复过程，对雌性大脑产生可能保护作用。FGF-2已知影响OPCs分化，支持血管生成，在维持血脑屏障完整性中起重要作用，促进细胞存活和增殖，并可调节炎症反应。FGF-2也在多种新生儿缺氧-缺血模型中发挥神经保护作用，可能在其他早产并发症（如脑室内出血）中起作用。实验结果明确证明雌性高氧处理OPCs上清对分化神经元存活的 beneficial effects可归因于FGF-2存在。

GLRX1通过逆转蛋白质谷胱甘化作用和维持细胞内外的氧化还原稳态，在减轻氧化应激中发挥直接作用。尽管未能将FGF-2和GLRX1联系起来，但这些因子共同可能指示雌性特异性抵抗高氧诱导氧化应激的稳健机制。雌性OPCs选择性分泌这些因子也暗示固有的性别差异。

讨论性别差异时，考虑早期产后发育中内源性睾酮水平是审慎的，这些可能影响OPCs对高氧的反应。尽管目前缺乏OPCs中睾酮-高氧相互作用的直接研究，但已知雄性小鼠幼崽在出生后前几天经历短暂睾酮激增。这种细胞分离前的激素预处理可能导致细胞应激反应的性别特异性差异，包括对氧化损伤的脆弱性。新生儿模型研究表明，睾酮可通过促进促凋亡和促炎症通路加剧脑损伤。在此背景下，尽管本研究未操纵激素水平，但雄性较高的内源性睾酮水平可能使OPCs对氧化应激敏感，促成观察到的差异反应。

分泌组及相关应激反应和存活差异机制可能解释早产儿神经系统结局的性别差异。此外，这些发现为OPCs基础生物学以及性别如何影响细胞功能提供了宝贵见解，可推动对这些差异驱动机制及其对整体大脑健康和功能影响的进一步研究。

4 实验方法

4.1 动物

小鼠方案经德国梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全和渔业部兽医和食品控制办公室批准。Crl:CD-1（ICR）小鼠从Charles River公司接收，为获得供体小鼠在设施内最多繁殖两代。该品系用于生成少突胶质前体细胞。

4.2 小鼠OPCs分离和培养

从酶解离的P2-P4日龄CD-1（野生型品系）小鼠脑中分离OPCs。每次分离，将同一窝三只雄性和三只雌性中脑区域（包含脑室下区）组织分别汇集。通过视觉和基因分型确定幼崽性别。所有细胞分离动物使用均按照机构动物伦理规定进行。

分离细胞在无血清生长培养基中培养，补充B-27（无视黄醇）、内皮生长因子（EGF）0.02 μg/mL和成纤维细胞生长因子（FGF）0.005 μg/mL，在3% O₂条件下。约5-6天后，当神经球直径约100 μm时，神经球生长培养基每两天逐渐更换为含寡球培养基的血清游离B104条件培养基，持续两周。此后时间，细胞胰蛋白酶化并用于实验。

为确认高氧后OPCs身份保留，进行O4免疫染色以及O4和CNPase免疫印迹以量化蛋白水平变化。另外，从细胞内质谱数据中单独分析了个别OPCs标志蛋白强度。

4.3 细胞系

B104神经母细胞瘤细胞系从ATCC购买。细胞仅用于制备OPCs培养的条件培养基。ReNcell VM（全文称ReNcell）从Merck Millipore获得。细胞用于进行XTT实验和测试OPCs上清效果。ReNcells在层蛋白包被培养器皿中，在ReNcell NSC维持培养基中培养，补充20 ng/mL EGF和bFGF，在21% O₂、5% CO₂和37°C条件下。为生成分化神经元，ReNcells在NSC维持培养基中培养至少7天，补充20 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）、B27补充剂、1 μM二丁酰cAMP和200 μM抗坏血酸（神经元分化培养基）。

4.4 不同氧浓度处理和上清收集

雌雄来源OPCs细胞胰蛋白酶化、计数并以相等密度接种到6孔板中，每孔含1 mL DMEM/F12 + 50.6 mM葡萄糖培养基。随后，板维持在两种不同氧水平80% O₂（高氧）和3% O₂（常氧），在5% CO₂和37°C下孵育24小时。从每孔收集上清，不扰动细胞，3000 rpm离心15分钟去除细胞和碎片。上清-80°C冷冻并用于功能实验。

4.5 质谱蛋白质组分析

用Bradford实验测定细胞外蛋白浓度，DMEM培养基作为参考。平均蛋白浓度为0.04 ± 0.048 μg/μL。

用M-PER裂解缓冲液提取ReNcells细胞内蛋白，按照制造商方案进行。通过离心收集含蛋白上清，通用核酸酶酶促降解核酸。通过BCA实验测定蛋白浓度。

每样本4 μg蛋白体积进行基于磁珠的SP3 protocol，包括蛋白还原和烷基化、胰蛋白酶消化（16小时，胰蛋白酶与蛋白比例1:25）以及从肽溶液中分离低分子量污染物。肽通过LC-ESI串联质谱在QExactive质谱仪上分析。细胞外蛋白肽数据依赖模式记录的质谱通过MaxQuant软件和Analyst分析。ReNcells细胞内蛋白肽在数据非依赖模式下记录，减少缺失值并允许蛋白稳健定量。使用Spectronaut v.18进行分析。排除含氧化甲硫氨酸肽后，在肽水平进行统计分析，使用ROPECA算法。仅显示不同丰度（使用Benjamini-Hochberg多重检验校正adj. p value < 0.05）的蛋白用于进一步考虑。使用R stats package v4.4.0中aov函数测试性别、处理及术语交互作用的影响。

4.6 FGF-2 ELISA

进行FGF-2酶联免疫吸附 assay（ELISA）以量化不同处理条件下雌雄OPCs上清中FGF-2量。按照Mouse FGF-2（bFGF）ELISA Kit方案进行。对四个独立生物学重复的上清进行FGF-2 ELISA测试。

4.7 XTT细胞存活实验

XTT还原实验常用于细胞存活测量。实验依赖于代谢活性存活细胞将黄色四唑盐（XTT）裂解形成橙色水溶性甲臜产物。实验在透明平底96孔板中进行，每孔总体积100 μL。

ReNcells以每孔250,000细胞密度接种96孔板。接种后第二天起，细胞在神经元分化培养基中培养七天，期间允许分化为神经元。神经元分化后，保持未处理（Ctrl_N），或用OPCs上清和抑制剂/FGF-2在常氧条件下处理24小时。通过将细胞在80%O₂下维持24小时生成可比高氧对照（Ctrl_H）。处理后，通过添加XTT评估细胞存活率，六小时孵育后测量光密度。使用Spectra Max Plus板阅读器读取555 nm吸光度，655 nm作为参考波长。

对五个不同生物学重复的上清进行XTT实验。

4.8 量化和统计分析

统计参数包括n精确值、中心定义、离散和精确度测量（mean ± SEM）和统计显著性在图和图例中报告。当p < 0.05时判断数据具有统计显著性，采用双尾Student's t检验计算，除非另有说明。

4.9 数据和软件可用性

质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库 deposited to the ProteomeXchange Consortium，OPCs和ReNcell数据集标识号分别为PXD060307和PXD060285。

用于分析部分蛋白质组学数据的Metascape是免费软件。使用Qiagen的Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件对ReNcells蛋白质组结果进行功能分类。