下丘脑室旁核催产素神经元三维定量揭示两种自闭症遗传小鼠模型中性别及亚区特异性差异

本研究发现，通过整合全脑OXT免疫标记、SHIELD组织透明化、光片显微镜及三维机器学习细胞检测技术，在Cntnap2和Fmr1基因敲除（KO）小鼠模型中，首次实现了下丘脑室旁核（PVN）亚区水平OXT免疫阳性（OXT+）神经元的高通量三维定量分析，揭示了存在性别与亚区特异性的OXT神经元分布差异，为自闭症谱系障碍（ASD）的神经生物学机制提供了新的空间分辨证据，凸显了完整组织三维定量方法在解析复杂脑区细胞分布中的重要性。

　　

1 INTRODUCTION

催产素（OXT）是一种在社会功能中起关键作用的神经肽激素，其在自闭症谱系障碍（ASD）神经生物学中的作用日益受到关注。已有研究报道多种ASD遗传小鼠模型存在中枢OXT系统紊乱，但对这些表型的详细系统表征及跨模型共有与独有特征的识别仍显不足。本研究整合全脑OXT免疫标记、SHIELD组织透明化、光片显微镜成像和基于机器学习的三维细胞检测技术，建立了一套基于完整组织的高通量分析流程，并在两种ASD遗传小鼠模型（Cntnap2和Fmr1基因敲除小鼠）中对下丘脑室旁核（PVN）各亚区的OXT免疫阳性（OXT+）神经元进行了定量分析。

2 MATERIALS AND METHODS

实验使用C57BL/6J背景的小鼠，包括Cntnap2和Fmr1基因敲除模型及其野生型（WT）同窝对照。通过心脏灌流获取脑组织，分别采用传统切片免疫荧光法和全脑SHIELD透明化结合光片成像进行OXT神经元标记与成像。使用抗神经垂体素（NP）抗体PS38进行免疫标记，并通过Neurolucida 360软件进行三维细胞检测与手动校正。为标准化比较，将细胞沿前后轴坐标进行归一化处理，并划分为四个PVN亚区（rostral, rostro-middle, middle, caudal）进行统计分析。

3 RESULTS

3.1 2D tissue section-based analysis of PVN OXT+ cell counts reveals subregion and sex differences in both KO models

传统切片分析显示，两种KO模型在PVN不同亚区存在性别依赖的OXT+神经元数量变化。Cntnap2^?/?雄性小鼠和Fmr1^?/Y雌性小鼠在rostro-middle亚区神经元数量增多，而Cntnap2^?/?雌性小鼠在middle亚区数量减少。此外，在两种KO模型中均发现WT中未出现的性别间差异。

3.2 3D intact tissue analysis of PVN OXT+ cell counts replicates 2D analysis results and reveals novel subregional differences in both KO models

全脑三维分析不仅验证了切片水平的结果，还发现了新的亚区差异，尤其是在细胞密度较低的rostral和caudal区域。Cntnap2^?/?雄性在rostro-middle区增多、caudal区减少，雌性则在rostro-middle和middle区减少、caudal区增多。Fmr1^?/Y雄性在rostral和middle区神经元数量显著减少，而雌性在rostro-middle区增多。这些结果凸显了三维体积分析在捕捉空间局部表型方面的优势。

4 DISCUSSION

本研究通过两种定量流程在两种ASD风险基因突变小鼠模型中揭示了PVN内OXT+神经元存在性别与亚区特异性的分布差异。两种方法一致发现rostro-middle和middle亚区的基因型差异，而全PVN体积分析进一步发现rostral和caudal区域的差异，表明体积分析方法具有更高灵敏度。这些发现提示，ASD相关基因突变对中枢OXT系统的影响存在模型间共性与独特性，且受到性别与脑区特异性的共同调控。

4.1 Section-based versus whole-PVN quantification of OXT+ neurons

传统切片定量方法因采样偏差可能掩盖PVN等复杂脑区的空间异质性，而基于SHIELD透明化、光片成像与三维细胞检测的全脑分析流程有效克服了这一局限，实现了更精确的细胞计数与空间分布解析。

4.2 Possible identity of affected OXT+ neuronal subtype in the two mouse models

PVN中的OXT神经元可分为大细胞（magnocellular）和小细胞（parvocellular）两类，其分布具有前后轴特异性。本研究发现的亚区特异性细胞数量变化提示两种模型可能分别影响不同亚型的OXT神经元，其中middle区（富含parvocellular神经元）的减少可能与社交表型相关。

4.3 Potential phenotypic convergence in PVN OXT+ cellular distribution patterns between the two mouse models and relevance to social phenotype

尽管Cntnap2和Fmr1基因功能不同，但二者缺失均导致PVN内OXT+神经元分布异常，提示中枢OXT系统可能是不同ASD风险基因导致社交表型的共同汇聚点。相反方向的细胞数量变化可能反映了OXT水平与社交行为之间的“倒U型”关系，为ASD的异质性机制与个体化治疗提供了新视角。

4.4 Other implications

未来研究可关注OXT神经元表型的发展动态、AVP系统的变化以及其他脑区与细胞类型的作用，从而更全面理解ASD的神经机制与干预策略。

本研究首次在两种ASD遗传模型中系统揭示了PVN OXT神经元的三维分布存在性别与亚区特异性差异，为理解ASD的神经生物学基础和发展靶向治疗提供了重要依据。