单次与重复博来霉素诱导小鼠特发性肺纤维化模型的肺功能、组织学及细胞衰老特征差异研究

本文系统比较了单次与重复博来霉素（BLEO）诱导的小鼠特发性肺纤维化（IPF）模型，发现重复给药模型能更持久地模拟人类IPF的进行性纤维化特征，包括持续的胶原沉积、肌成纤维细胞活化及细胞衰老表型，为抗纤维化和衰老靶向治疗研究提供了更可靠的临床前平台。

　　

1 引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性间质性肺病，其特征是细胞外基质（ECM）成分过度沉积，导致组织瘢痕形成和肺功能逐渐下降。IPF预后较差，诊断后中位生存期仅为3-5年。当前IPF研究面临的主要挑战是临床前研究结果向临床疗效转化的局限性。现有动物模型往往无法完全复制人类IPF的慢性和进行性特征，从而阻碍了新治疗策略的开发。

单次（"急性"）气管内博来霉素（BLEO）滴注小鼠模型是临床前IPF研究和药物开发中广泛使用的模型。该模型通过BLEO介导的肺泡上皮细胞（AECs）损伤诱导肺纤维化，触发广泛的促纤维化信号传导，包括细胞周期停滞、上皮功能障碍、肌成纤维细胞分化和基质重塑。然而，单次BLEO-IPF小鼠模型中的肺纤维化损伤会随时间自发消退，这与人类IPF的进行性特征不同。因此，需要一种能更准确反映IPF中进行性和持续性纤维化及上皮重塑的小鼠模型。

重复BLEO滴注已被报道可诱导更持久（"慢性"）的肺纤维化特征，更接近IPF中特征性的反复肺泡上皮损伤。与IPF患者相似，这一过程以成纤维细胞和肌成纤维细胞的持续过度激活为标志，导致过度和持续的胶原沉积及随之而来的肺功能进行性下降，从而为抗纤维化药物的疗效测试提供更宽的时间窗口。

有趣的是，细胞衰老（一种由应激或损伤诱导的永久性细胞周期停滞状态）近年来已成为IPF纤维化的重要驱动因素。衰老细胞抵抗凋亡，使其能够持续存在并促进肌成纤维细胞活化，同时抑制纤维化消退，从而在没有持续纤维发生的情况下维持ECM沉积。衰老细胞的积累在IPF患者的肺中有报道，特别是在肺泡上皮细胞和成纤维细胞群体中。衰老相关分泌表型（SASP）的分子成分被认为是衰老细胞有害作用的主要介质，涉及多种信号分子的合成和分泌，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶进入肺组织微环境，耗尽组织修复机制以促进纤维化。

与临床发现一致，重复BLEO-IPF小鼠模型显示出肺SASP因子的显著上调，包括H2AX、转化生长因子-β（TGF-β）和各种基质金属蛋白酶（MMPs），这些可以强化纤维化微环境。因此，重复BLEO-IPF小鼠可能提供比单次BLEO-IPF小鼠更具进行性和临床相关性的疾病表型，但其在临床前IPF研究中的适用性仍有待充分验证。为填补这一空白，我们系统比较了小鼠中重复与单剂量BLEO给药诱导的肺病表型，特别关注肺纤维化和细胞衰老的特征。

2 材料与方法

2.1 伦理

所有实验均经丹麦动物实验监察局批准（许可证号#2018-15-0201-01532和#2023-15-0201-01454）。所有动物实验遵循Gubra生物伦理指南，遵守国际接受的实验室动物护理和使用标准。

2.2 动物

雄性C57BL/6JRj小鼠订购自Janvier Labs（法国），饲养在受控环境中（12小时光/暗循环，21°C±2°C，湿度50%±10%）。每只动物通过可植入皮下微芯片（PetID Microchip）进行识别。小鼠自由摄取自来水和饲料（Altromin 1324）。

2.3 单次BLEO-IPF小鼠模型

12周龄雄性C57BL/6JRj小鼠接受单次气管内滴注硫酸博来霉素（2.0 mg/kg，3 U/kg，溶于50 μL无菌0.9%盐水，n=12）或0.9%盐水作为载体对照（50 μL）。盐水滴注的小鼠作为健康对照，所有动物每天一次（QD）口服（PO）载体，持续3周，以模拟治疗干预研究中的操作。每天监测体重，21天后处死动物。

2.4 重复BLEO-IPF小鼠模型

12周龄雄性C57BL/6JRj小鼠在4周内每两周接受三次气管内滴注BLEO（1.75 mg/kg，2.63 U/kg，50 μL）或载体（无菌0.9%盐水，50 μL）。BLEO动物被分配到基线组（n=13，在研究第1天终止，即首次BLEO剂量后6周）或重复BLEO-IPF组（n=17，在研究第8周终止，即首次BLEO剂量后14周）。接受气管内盐水滴注的对照小鼠（n=10）在研究第8周终止。所有动物每天监测体重，并接受载体（PO，QD）以模拟干预研究中的操作。

BLEO-IPF小鼠根据体重随机分层到"模拟"治疗组，仅当表现出5%-20%的体重减轻（作为BLEO诱导肺损伤的代理指标）时才考虑纳入。

2.5 肺功能测定

终末采血后，通过颈椎脱位处死动物。随后进行气管造口术，将18G（1 mm）金属插管插入气管，并用缝线固定。然后将动物连接到flexiVent系统（SCIREQ，加拿大）。为标准化肺容积和确定吸气容量，进行深吸气，将小鼠肺在3秒内充气至30 cmH₂O压力，并在此压力下暂停3秒。生成压力-容积（PV）环以评估呼吸系统的静态顺应性（Cst）。然后执行负压驱动的强制呼气 maneuver，通过在1秒内将肺充气至30 cmH₂O，维持此压力2秒，随后将动物气道连接到负压储液器（-50 cmH₂O）2秒。从肺放气期间产生的流量-容积环直接计算0.1秒内强制呼气量（FEV0.1）和强制肺活量（FVC）。每个 maneuver 重复三次以确保准确性，确定系数0.95设为接受测量的阈值。

2.6 组织采样

全血样本收集在EDTA包被的管中并置于冰上。血液样本离心10分钟（4°C，3000 g）以生成EDTA稳定血浆。上清液分装并储存在-70°C供进一步分析。取出肺并称重。随后，通过切割右支气管分离右肺，并取样用于生化（上叶和中叶）和RNA测序（下叶）。右肺样本储存在-70°C直至处理，左肺用于组织学。

2.7 肺羟脯氨酸含量

右上叶和中叶样本在6 M HCl中匀浆并水解以降解胶原。匀浆液离心，使用比色法试剂盒（Quickzyme Biosciences，荷兰）测量上清液中的羟脯氨酸（HP）含量。

2.8 Ashcroft纤维化评分和定量肺组织学

分离的左肺叶气管插管，并用10%中性缓冲福尔马林（NBF）以恒定压力灌注固定5分钟。随后，左肺转移到含有10% NBF的小瓶中，室温浸泡固定过夜，转移到70%乙醇中，并储存在4°C直至进一步处理。组织然后放置在Tissue-Tek VIP? 6 AI真空渗透处理器（Sakura Finetek，美国）中以便在包埋前渗透。使用切片机以4 μm厚度切片，并安装在Starfrost载玻片（Knittel，德国）上。对于Ashcroft评分，切片用Masson三色（MT）染色。应用基于深度学习的自动数字成像方法[Gubra组织病理学客观评分技术，GHOST]进行自动组织病理学评分，使用Ashcroft评分系统。

对于组织形态计量分析，切片用Picro Sirius red（PSR）、抗I型胶原（Col1a1）、抗III型胶原（Col3）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗半乳糖凝集素-3（Gal-3）、抗CD45、抗CD3、抗CD20或抗p21染色，使用标准程序。载玻片使用20倍物镜扫描（Aperio AT2，Leica Biosystems）。使用数字成像软件（Visiomorph；Visiopharm，丹麦）进行定量组织学，以确定全切片肺纤维化（PSR、Col1a1、Col3）、成纤维细胞活化（α-SMA）、炎症（Gal-3、CD45、CD20、CD3）和细胞衰老（p21），分别表示为阳性染色相对于总切片面积的百分比（%）。

2.9 肌成纤维细胞衰老的组织学分析

4 μm切片在Leica rm2255旋转切片机（德国）上切割，并用抗α-SMA（1:500）和抗p16（1:200）抗体染色。使用荧光偶联二抗（1:100）。每只小鼠捕获五张图像，并在Zeiss Axiovert 200 M（Zeiss，德国）上以盲法评估，使用20倍物镜和数字成像软件（AxioVision；Zeiss，德国）。对每只小鼠，捕获五个代表性视野，并进行立体学网格计数以量化α-SMA⁺细胞（指示活化的成纤维细胞/肌成纤维细胞）和α-SMA⁺/p16⁺双阳性细胞（衰老的肌成纤维细胞）。从十二个视野计算每只小鼠的平均值，并从每个实验组内个体小鼠平均值得出组水平均值。

2.10 肺RNA测序

下叶样本在裂解缓冲液中匀浆，并使用NucleoSpin? RNA结合条（Macherey-Nagel，德国）纯化RNA。使用NanoDrop 2000测量RNA纯度和浓度，并使用NEBNext? Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（New England Biolabs，美国）制备cDNA文库。cDNA文库在NextSeq 500系统（Illumina，美国）上测序至每个样本约1500万读段深度（单端，75 bp读段），使用NextSeq 500/550 High Output Kit版本2.5（Illumina）。使用STAR版本2.7.0f将读段比对到GRCm38 release 96 Ensembl小家鼠基因组。所有下游分析使用R版本3.6.0进行。对于差异基因表达分析，使用R包DESeq2，p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正（5%错误发现率，FDR <0.05）。将BLEO-IPF小鼠的肺全局基因表达变化与先前报道的终末期IPF患者的RNA测序数据进行比较。此外，针对一组与人类IPF、纤维化和衰老相关的269个基因的精选集，探测了BLEO-IPF小鼠的肺转录组特征。使用R包Piano进行基因集富集分析。

2.11 统计学

除基于深度学习的图像分析和RNA测序外，数据使用GraphPad Prism版本10.2.1进行分析。结果以均值±标准误（SEM）表示。使用D'Agostino和Pearson综合正态性检验评估单次和重复BLEO-IPF数据集的正态分布。对于单次BLEO-IPF研究，正态分布数据使用非配对t检验或Welch t检验（如适用，以考虑不等方差）进行分析。如不满足正态性，则使用Mann-Whitney U检验分析数据。使用R包pwr进行功效分析，以基于经验效应大小确定最小样本量。我们确认>99%的效能检测FVC差异≥0.28单位（Cohen's d=1.56）和>99.9%的效能检测PSR胶原差异≥7.2单位（d=2.32），单次BLEO-IPF数据集中每组最小所需样本量分别为5和3，以达到80%效能。对于重复BLEO-IPF数据集，正态分布数据使用单因素方差分析（ANOVA） followed by Dunnett多重比较检验进行分析。如不满足正态性，则使用Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验。对于具有不等方差（通过Brown-Forsythe检验评估）的数据集，使用Welch单因素ANOVA代替标准ANOVA。p值≤0.05被认为具有统计学意义。功效分析显示>98%的效能检测FVC差异（ANOVA f=0.51）和>99%的效能进行PSR比较（f=0.68），分别需要每组最小样本量6和5以达到80%效能。

为确保稳健检测次要终点和纤维化进展的潜在变异性，两个研究队列的样本量均增加，超过了最低要求。所有分析的统计学显著性设置为p≤0.05（双尾）。

3 结果

3.1 单次与重复BLEO-IPF小鼠模型中相当的代谢和生化特征

在通过单次或重复BLEO滴注方案建立的两种BLEO-IPF小鼠模型中评估了代谢和生化特征。在单剂量BLEO-IPF小鼠中，BLEO-IPF载体组的体重在随机分组时显著降低，终止时仍然较低，而肺重量和HP含量与CTRL相比显著增加。重复BLEO-IPF小鼠的基线和8周BLEO-IPF组在随机分组和终止时体重与CTRL组相比也显示类似降低。与CTRL相比，两个BLEO-IPF组的肺重量和HP含量也增加，8周时肺重量显著低于基线。

3.2 单次与重复BLEO-IPF小鼠模型中不同的肺功能缺陷

在单次BLEO-IPF小鼠模型中，所有评估的肺功能参数（FEV0.1、FVC、IC、Cst）在终止时BLEO-IPF载体组与相应CTRL组相比均显著降低。在重复BLEO-IPF小鼠模型的基线时发现了类似变化，尽管这种降低仅在8周后对FEV0.1保留。

3.3 重复BLEO-IPF小鼠模型中持续性纤维化的组织学证据

使用基于AI的Gubra组织病理学客观评分技术（GHOST）平台评估肺纤维化。与CTRL相比，单次BLEO-IPF小鼠的Ashcroft评分显著增加。这一发现得到定量组织学（PSR、Col1a1、Col3、α-SMA）的支持。在重复BLEO-IPF小鼠中，Ashcroft评分和定量组织学标志物（PSR、Col1a1、Col3、α-SMA）在基线和第8周均保持升高。值得注意的是，PSR和Col3的分数面积在第8周与基线测量相比进一步增加。

3.4 单次与重复BLEO-IPF小鼠模型中不同的炎症特征

为了评估两种BLEO-IPF模型中的炎症，分析了广泛炎症细胞群体的定量免疫组织化学标志物，包括CD45、Gal-3、CD3和CD20。在单次BLEO-IPF模型中，与CTRL相比，BLEO-IPF动物的CD45、Gal-3、CD3和CD20水平显著升高。在重复模型中，与CTRL组相比，基线和8周BLEO-IPF组的Gal-3和CD3水平显著升高。然而，Gal-3水平在第8周与基线相比降低。相比之下，CD45和CD20水平仅在第8周发现显著升高。

3.5 单次与重复BLEO-IPF小鼠模型中不同的肺转录组特征

分析了与炎症、ECM和TGF-β相关的肺基因表达变化，参考终末期IPF患者中报道的相应数据。将数据集与相应的盐水对照组进行比较。维恩图量化了小鼠模型和人类IPF之间DEG的重叠，而精选的基因面板特别比较了炎症、ECM和TGF-β通路基因的转录变化。单次BLEO-IPF小鼠显示与CTRL相比上调和下调DEG数量最高（分别为2718和2859），同时也显示与人类IPF的转录重叠，捕获了25.0%的上调DEG和26.6%的下调DEG。此外，单次BLEO-IPF小鼠显示与人类IPF数据集相似的基因表达变化，炎症介质（Il6、Ccl2）、ECM成分（Col1a1、Col3a1、Fn1、Loxl2、Mmp2）和TGF-β通路信号（Tgfb1、Smad2）显著上调。在重复BLEO-IPF小鼠中，转录改变在研究过程中下降，基线样本显示1531个上调和1534个下调DEG，到第8周与各自对照相比减少到299个上调和210个下调DEG。两种模型之间的转录重叠也随时间减少，重复BLEO-IPF动物在基线时间点捕获了16.1%的上调DEG和19.0%的下调DEG，8周后下降到4.2%和2.2%。第8周DEG数量的减少伴随着几种纤维化标志物表达的减少，尽管与健康对照相比仍保持升高。炎症介质（Il6、Ccl2）、ECM成分（Col1a1、Col3a1、Fn1、Loxl2、Mmp2）和TGF-β信号基因（Tgfb1、Smad2）均显示与基线相比表达减少，但仍高于对照水平。这种模式在Col1a1中特别明显，显示近乎完全正常化，而Loxl2和Col3a1显示持续升高。虽然单次和重复BLEO-IPF小鼠模型在基线时表现出与促炎介质、ECM成分和TGF-β信号基因标志物 broadly similar 方向性变化，但这些通路中的许多DEG在BLEO模型和人类IPF之间不重叠。整个ECM成分，如基质金属蛋白酶显示广泛的跨物种一致性（Mmp14、Mmp19、Mmp2）；Mmp9是反向调节的（在BLEO-IPF小鼠中上调 versus 在人类IPF中下调）。此外，成纤维细胞生长因子标志物（如Fgf1和Fgf4）以及TGF-β信号标志物子集的调节在人类IPF患者中显示更一致的上调。

3.6 单次与重复BLEO-IPF小鼠模型中不同的肺细胞衰老特征

为了深入了解细胞衰老，分析了单次和重复BLEO-IPF小鼠中p21的免疫染色、p16+/α-SMA+衰老肌成纤维细胞的共免疫染色以及衰老相关转录组特征。对于单次BLEO-IPF小鼠，与CTRL相比，p21的%面积显著升高，并且p16和α-SMA双阳性细胞的相对比例（%）显著增加。转录组数据表明p21（Cdkn1a）和p16（Cdkn2a）显著上调，p21表达超过p16。单次BLEO-IPF小鼠反映了人类IPF转录组谱，诱导了H2afx（DNA损伤）、p53（Trp53）和Il6，以及Ccr5（免疫招募）和Timp1（ECM抑制）基因。对于重复BLEO-IPF小鼠，与CTRL相比，p21水平在基线和第8周升高，但在第8周与基线相比显著降低。免疫荧光显示，与基线和CTRL相比，第8周p16+/α-SMA+细胞显著增加。RNA测序显示，Cdkn1a表达在基线时升高，但在第8周下降，而Cdkn2a仅在基线时增加。此外，急性期标志物（H2afx、Trp53、Il6、Timp1）在第8周恢复到CTRL水平。

4 讨论

我们报道，重复BLEO给药，随后每日载体治疗以模拟临床前治疗研究中的操作，诱导了IPF特征性的持续组织病理学特征，以及与肺细胞衰老相关的 distinct 分子特征。总的来说，这些发现突出了重复BLEO-IPF小鼠作为临床前IPF研究中的相关临床前模型，并可能更好地支持针对IPF中促纤维化和细胞衰老相关机制的长期干预研究。

当前的比较研究证实并扩展了小鼠中重复 versus 单次BLEO给药方案诱导更持久肺纤维化损伤的发现。正如预期，单次BLEO滴注后4周纤维化的组织学标志物上调。需要注意的是，该模型的一个关键限制是肺纤维化的一致、自发消退，这通常在给药后3至4周左右开始，如我们团队和其他人先前报道。相比之下，重复BLEO-IPF小鼠在整个14周的研究期间显示肺HP含量升高以及通过Ashcroft评分和定量组织学（PSR、Col1a1、Col3）评估的持续纤维化损伤。增加的促纤维化活性通过增强的α-SMA表达反映出来，α-SMA是肌成纤维细胞积累的标准标志物。值得注意的是，PSR染色和Col3免疫染色与基线相比显著增加。相比之下，Col1a1免疫染色在此时似乎稳定。由于PSR主要标记I型和III型胶原，这可能特别指示重复BLEO-IPF小鼠中Col3-containing纤维的 advancing 沉积。因此，本研究的结果强调，重复BLEO-IPF小鼠中观察到的纤维化特征与相应单剂量模型中的组织病理学表型不同。一项在小鼠中表征类似重复BLEO滴注方案的研究，使用较低BLEO剂量（1 U/kg），也报道了首次滴注后28周肺胶原含量进行性增加，表明降低BLEO剂量导致纤维化肺损伤速率较慢，而我们观察到首次滴注后14周 already 进行性纤维化迹象。这很可能由我们模型中使用的较高BLEO剂量（2.63 U/kg）引起，表明增加的BLEO暴露可能加速重复BLEO-IPF小鼠模型中的纤维化重塑。

单次BLEO-IPF小鼠显示更广泛的纤维化基因表达标志物一致上调。应注意的是，指示单次BLEO-IPF小鼠中增强胶原合成的转录组特征是 transient 的，大约在给药后6周逐渐解决趋向正常化。虽然我们的肺RNA测序分析在基线时间点证实了重复BLEO-IPF小鼠中纤维化的组织学发现，但结构ECM成分（Col1a1、Col3a1、Fn1、Loxl2、Mmp2）和TGF-β信号（Tgfb1、Smad2）的子集在研究第8周时间点减弱或解决。第8周ECM重塑的这种转变指示模型中胶原周转调节的高度复杂动力学，这与先前研究的发现一致。总的来说，这些时间动力学很可能反映了响应BLEO毒性的 ongoing ECM重塑和组织修复机制，涉及调节纤维发生和胶原降解的广泛分子机制的贡献。

此外，虽然两种BLEO-IPF模型广泛反映了人类IPF的转录组特征，但 across a number of 纤维化信号标志物注意到分歧。功能上，这些差异表明，虽然重复BLEO-IPF模型表现出广泛的促纤维化转录组特征，但它以时间限制和损伤驱动的方式这样做，不复制在终末期人类IPF中观察到的持续生长因子和TGF-β信号。两种BLEO-IPF模型之间DEG重叠的进行性下降表明，每种模型捕获人类IPF中高度复杂的肺转录组变化的子集，与重复BLEO-IPF模型代表相对稳定的肺纤维化状态一致。此外，这些转录差异说明IPF的临床前模型和人类IPF代表不同的病理生理状态，在临床前研究背景下可以被认为是互补而不是冲突的。

除了肺纤维化特征，重复BLEO-IPF小鼠表现出持续性炎症的组织学特征，如第8周测量的CD45（泛白细胞标志物）、CD20（B细胞标志物）和CD3（T细胞标志物）染色增加所指示。持续的CD20+ B细胞存在与IPF患者中非淋巴组织中免疫细胞聚集有关，称为 tertiary lymphoid structures（TLS）。TLS形成与IPF中加速疾病进展和肺功能下降相关。支持这一点，B细胞衍生的细胞因子释放已被显示促进IPF患者中成纤维细胞迁移和增殖。因此，重复BLEO-IPF小鼠中升高的CD20信号可能反映通过持续B细胞激活永续纤维化的免疫机制。相比之下，Gal-3（活化巨噬细胞的标志物）在重复BLEO-IPF小鼠中第8周与基线相比显著降低，但仍显著高于健康对照小鼠，表明巨噬细胞浸润逐渐消退，如先前在可比BLEO模型中报道。

与持续性肺纤维化的组织学发现形成对比，重复BLEO-IPF小鼠表现出 transient 肺功能损伤，仅FEV0.1在第8周与基线相比显著降低，静态顺应性（肺弹性）与CTRL相比显示边缘显著性（p=0.08） toward 损伤。总体而言，肺量测定分析表明快速呼气期间早期气流受限，表明重复BLEO-IPF小鼠中持续轻度肺功能损伤。相比之下，单次BLEO-IPF小鼠在BLEO后4周显示所有测量的肺量测定终点（FVC、FEV0.1、IC和Cst）广泛下降。然而，重要的是，FEV0.1、Cst和FVC consistently 被报道在单次BLEO小鼠中BLEO后约6周正常化。应强调，本研究是第一个在小鼠重复BLEO诱导的IPF模型中报告完整肺功能谱使用肺量测定的研究。迄今为止，在可比重复BLEO-IPF模型中报告的肺量测定数据仅限于静态顺应性。此外，二氧化硅诱导的肺纤维化小鼠模型被报道显示持续性纤维化而没有 concurrent 肺量测定结果变化，表明这些复杂模型中肺组织学和功能结果之间可能出现脱节，需要进一步全面研究。

几个因素可能解释重复和单次BLEO-IPF小鼠模型之间肺功能的差异。早期小气道重塑和啮齿动物 substantial 的气道储备容量可能掩盖肺功能缺陷。这种差异也可能反映自然恢复，类似于单次BLEO-IPF模型中看到的自发消退。在此背景下，重复BLEO-IPF模型中炎症和肺水肿的消退可能缓解功能缺陷，如对单剂量BLEO模型所提示。然而，扩展的纵向监测可能揭示更大的ECM重塑和更一致的肺功能损伤，随着修复机制变得 exhausted。

肺细胞衰老 increasingly 被认识到在IPF的发生和进展中 playing a key role。衰老细胞，由应激源如端粒损耗或氧化损伤诱导，采用SASP驱动炎症和ECM重塑， thereby 促进肺纤维化在IPF中的持续性。为了获得对细胞衰老在基于BLEO的IPF模型中作用的进一步 insight，我们评估了重复和单次气管内BLEO滴注后细胞衰老的组织学和转录标志物。在两种模型中，免疫组织化学分析显示标准细胞衰老标志物p16和p21水平持续升高。在重复BLEO-IPF小鼠中，与基线相比，p16/α-SMA双阳性肌成纤维细胞数量 further 增加。相比之下，p21水平在研究过程中下降。这种分歧可能潜在反映肌成纤维细胞异质性和/或p16和p21在细胞衰老信号传导中的 distinct 作用。因此，p21（p53驱动的早期反应抑制剂）表达随着急性DNA损伤信号解决而下降，而p16强制执行不可逆细胞周期退出