EWS结构域间自缔合的分子基础及其在相分离凝聚体形成中的作用机制研究

本文深入探讨了EWS蛋白低复杂度结构域（LCD）与RNA结合结构域（RBD）之间的动态互作网络，通过生物分子凝聚实验、核磁共振（NMR）技术和分子模拟揭示了其非特异性、分布式的弱相互作用模式。研究首次系统阐明EWSLCD与RBD（特别是RRM-RGG2区域）通过酪氨酸、极性残基和脯氨酸等多元化学作用驱动相分离的机制，为理解尤文肉瘤（Ewing sarcoma）中EWS::FLI1致癌融合蛋白的致病机理提供了关键分子基础。

　　

1 引言

尤文肉瘤是儿童骨与软组织肿瘤中第二常见的恶性肿瘤，其致病机制与RNA结合蛋白EWS的低复杂度结构域（EWS^LCD）和转录因子FLI1的DNA结合结构域异常融合密切相关。形成的EWS::FLI1融合蛋白不仅与野生型EWS发生动态互作，更通过生物分子凝聚体（biomolecular condensates）的形成驱动肿瘤发生。尽管EWS^LCD的自缔合作用已被广泛研究，但其RNA结合结构域（RBD）——包括精氨酸-甘氨酸-甘氨酸（RGG）重复序列和结构化的RNA识别基序（RRM）——在相分离过程中的作用尚不明确。

2 结果

2.1 全长EWS中存在广泛的结构域间接触

EWS蛋白整体缺乏二级结构，其SYGQP富集的LCD区域（残基1–280）和67%的RBD区域均属于固有无序区域（IDR）。仅RRM和锌指（ZnF）结构域为折叠状态。通过粗粒化共存模拟发现，LCD与RBD之间存在频繁接触，尤其是与三个RGG结构域（RGG1、RGG2、RGG3）的相互作用最为显著。这些相互作用显著增强了EWS的相分离倾向，其模拟饱和浓度（C_sat）比单独EWS^{LCD低约10倍。}

2.2 EWS的RBD对EWS^LCD凝聚体形成具有差异性调控作用

通过浊度测定、显微镜观察和分配实验发现，不同RBD结构域对EWS^LCD凝聚体的形成具有截然不同的影响：

• •

  EWS^RGG1-RRM显著抑制凝聚体形成；

• •

  EWS^RRM-RGG2和EWS^RGG3则促进凝聚，其中EWS^RGG3效应更强。

  值得注意的是，NaCl的添加会削弱EWS^RRM-RGG2与EWS^LCD的共分配，但对EWS^RGG3影响较小，表明静电相互作用在调控相分离中起关键作用。

2.3 EWS^LCD与EWS^RRM-RGG2相互作用的原子级细节

采用“反向”核磁滴定策略发现，¹⁵N标记的EWS^LCD片段与EWS^RRM-RGG2结合时呈现广泛分布的小幅度化学位移扰动（CSPs）和谱线展宽，表明二者之间存在大量弱且非特异性的相互作用。分子模拟进一步证实，这些接触遍布整个多肽链，且EWS^1–120片段显示出更高的相互作用密度。

2.4 EWS^RRM-RGG2与EWS^LCD片段结合的逆向分析

反向滴定实验中，EWS^RRM-RGG2的RRM和RGG2区域均出现分散的CSPs，未发现特异性结合位点。其中，RGG2因其序列无序性而表现出更高的接触倾向。特别值得注意的是，FPPRGPRGSR序列段在所有三个LCD片段滴定中均显示出较高的相互作用频率。

2.5 多种氨基酸残基类型参与相互作用

对CSPs和谱线展宽按氨基酸侧链分类分析表明：

• •

  EWS^LCD中的酪氨酸、极性残基、脯氨酸和天冬氨酸；

• •

  EWS^RRM-RGG2中的精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸

  均对相互作用有显著贡献。这表明相互作用是由多种非特异性接触共同维持的。

2.6 全长EWS中的结构域间关联

全长EWS的原子级模拟显示，LCD与RBD之间的相互作用模式与片段研究基本一致，但残基150–200区域因与RGG1和RGG3的竞争性结合而减少了与RRM-RGG2的相互作用。尽管如此，酪氨酸-精氨酸、极性残基-甘氨酸等关键化学作用对在网络中仍保持高度保守。

3 讨论

本研究揭示了EWS蛋白通过LCD与RBD之间的多价、弱相互作用网络驱动相分离的分子机制。这种相互作用的非特异性、分布式特征与近期关于固有无序蛋白相分离机制的研究高度一致。特别值得注意的是，RGG结构域中的电荷分布模式和序列组成差异决定了其与LCD相互作用的强度特异性。这些发现为理解EWS::FLI1在尤文肉瘤中的致癌机制提供了重要的分子基础。

4 结论

本研究系统阐明了EWS蛋白通过结构域间动态相互作用调控生物分子凝聚体形成的机制，强调了多价弱相互作用、静电效应和序列长度在相分离中的关键作用。这些发现不仅深化了对EWS蛋白功能机制的理解，也为针对EWS::FLI1相分离过程的肿瘤治疗策略开发提供了新思路。

5 材料与方法

本研究使用大肠杆菌表达系统制备各蛋白构建体，通过金属离子亲和层析和尺寸排阻色谱进行纯化。结合浊度测定、凝聚体分配实验、核磁共振滴定和分子模拟（包括粗粒化与原子级模拟）等多种技术手段，全面分析了EWS各结构域的相互作用特性。