ATG8介导的选择性自噬通过降解SDE4040效应蛋白抑制柑橘黄龙病菌感染的机制研究

本研究针对柑橘黄龙病（HLB）的防治难题，通过分子生物学和植物病理学方法，揭示了CsATG8c介导的选择性自噬通过降解'Candidatus Liberibacter asiaticus'（CLas）毒力效应蛋白SDE4040，抑制细菌增殖的分子机制。该研究不仅阐明了自噬通路在植物免疫中的新功能，还为培育抗病柑橘品种提供了重要靶点，对保障柑橘产业健康发展具有重要意义。

　　

柑橘产业在全球农业经济中占据重要地位，然而由韧皮部限制性细菌"Candidatus Liberibacter asiaticus"（CLas）引起的黄龙病（Huanglongbing, HLB）对其造成严重威胁。这种病害导致柑橘果实品质急剧下降，表现为果型变小、着色异常、汁液减少、糖酸含量降低，并增加落果率，最终影响产量和商品性。CLas通过Sec依赖性分泌系统释放效应蛋白，操纵宿主生理过程以促进细菌入侵和逃避植物防御。尽管先前研究发现多个CLas效应蛋白（如SDE1、SDE15）通过抑制宿主免疫反应促进病原菌增殖，但植物如何通过自身免疫机制对抗CLas感染仍不清楚。

在此背景下，本研究聚焦于自噬（autophagy）这一保守的细胞降解回收过程。自噬通过将不需要的蛋白质或受损细胞器运输至液泡进行降解和循环利用，在真核生物的细胞稳态调节、应激适应和程序性细胞死亡中起关键作用。选择性自噬通过自噬机制特异性靶向降解受损细胞器、蛋白质聚集体或细胞内病原体，从而精确调控植物免疫。ATG8作为选择性自噬中的关键蛋白，通过与自噬受体/适配器相互作用实现特异性货物识别。已有研究表明，ATG8可直接降解病原体毒力因子，如棉花曲叶病毒（CLCuMuV）的BC1蛋白和云南番茄曲叶病毒（TLCYnV）的C1蛋白，从而增强植物抗病性。

本研究通过农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的毛根转化技术，将CsATG8c过表达载体导入感染CLas的枳橙（Poncirus trifoliata）茎段，成功获得三个过表达株系（OE-1、OE-3、OE-4）。荧光检测、PCR和RT-qPCR验证了转化成功，并通过qPCR监测细菌生长，发现CsATG8c过表达显著抑制了CLas增殖。通过双分子荧光互补（BiFC）筛选，发现CsATG8c与CLas效应蛋白SDE4040直接相互作用，该作用经GST pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）进一步证实。值得注意的是，SDE4040不包含典型的ATG8互作 motif（AIM），表明其相互作用可能是AIM非依赖性的。

进一步研究发现SDE4040定位于细胞膜、细胞核和细胞质，并能够抑制BAX和INF1诱导的过敏反应（HR）和过氧化氢（H₂O₂）积累。通过转录组测序分析SDE4040过表达植株，发现1855个差异表达基因（DEGs），其中植物激素转导、植物-病原互作和MAPK信号通路相关基因显著下调。特别是HR相关基因（CNGCs、CDPK、Rboh、RIN4、COXI、MPK3/6）和茉莉酸（JA）通路基因的下调，以及JA含量的降低，表明SDE4040通过抑制宿主HR和JA信号促进CLas感染。表型验证实验显示SDE4040过表达显著增加了CLas滴度。

机制研究表明，CsATG8c通过自噬途径介导SDE4040降解。Western blot分析显示，与CsATG8c共表达时SDE4040蛋白积累显著降低，且自噬抑制剂E-64 d（而非蛋白酶体抑制剂MG132）能够逆转这一过程。共聚焦显微镜观察显示CsATG8c-SDE4040互作复合物与自噬标记蛋白CFP-NbATG8f在细胞质中共定位，证实了SDE4040被导向自噬体降解。

本研究首次揭示了ATG8介导的选择性自噬通过降解CLas毒力效应蛋白SDE4040限制细菌感染的分子机制。SDE4040作为毒力效应子，通过抑制宿主HR和降低JA水平促进CLas增殖，而柑橘ATG8蛋白通过识别并降解SDE4040增强宿主防御。这些发现不仅阐明了植物自噬在抵抗CLas感染中的作用，还为HLB防控策略提供了新思路。

主要技术方法包括：1）使用农杆菌介导的毛根转化系统在CLas感染的枳橙中实现基因过表达；2）通过双分子荧光互补（BiFC）、GST pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作；3）采用转录组测序（RNA-seq）和RT-qPCR分析基因表达；4）利用Western blot和抑制剂处理分析蛋白降解途径；5）通过共聚焦显微镜进行亚细胞定位和共定位分析。

研究结果部分：

CsATG8c过表达抑制柑橘中CLas增殖：通过毛根转化系统获得CsATG8c过表达株系，qPCR分析显示CLas滴度显著降低，表明ATG8介导的自噬在柑橘防御CLas感染中起关键作用。

CsATG8c与SDE4040物理互作：BiFC筛选发现CsATG8c与SDE4040等4个效应蛋白互作，GST pull-down和Co-IP证实了CsATG8c-SDE4040相互作用，且该作用不依赖典型AIM结构域。

SDE4040抑制本氏烟过敏反应：亚细胞定位显示SDE4040定位于细胞膜、细胞核和细胞质。瞬时表达实验表明SDE4040抑制BAX和INF1诱导的HR和H₂O₂积累。

SDE4040过表达柑橘的差异表达基因：转录组分析发现1855个DEGs，KEGG富集显示植物激素转导、植物-病原互作和MAPK信号通路相关基因下调，HR相关基因和JA通路基因表达降低，JA含量减少。

SDE4040过表达促进CLas增殖：毛根转化实验表明SDE4040过表达显著增加CLas滴度，证实其作为毒力效应子促进病原菌感染。

CsATG8c通过自噬途径介导SDE4040降解：Western blot显示CsATG8c促进SDE4040降解，自噬抑制剂E-64 d逆转这一过程。共定位实验显示CsATG8c-SDE4040复合物与自噬标记蛋白NbATG8f共定位于自噬体。

讨论与结论部分指出，操纵自噬通路为创建抗病作物提供了新机遇。本研究首次证明柑橘ATG8通过选择性自噬降解CLas效应蛋白SDE4040，SDE4040通过抑制HR和JA信号促进细菌感染。这些发现不仅揭示了植物自噬在限制CLas增殖中的作用，还为HLB治理提供了新的分子靶点。未来研究应进一步探索ATG8与CLas效应蛋白互作的分子细节，以及增强自噬通路对抗CLas感染的潜在应用价值。