综述：用于原位液相透射电子显微镜的石墨烯基液体池设计：最新进展与展望

这篇综述系统总结了石墨烯液体池（GLC）在液相透射电子显微镜（TEM）中的最新设计进展与应用。文章重点介绍了四种GLC构型（veil-type、well-type、liquid-flowing-type和mixing-type），详细阐述了它们在实现原子级分辨率成像、提升成像稳定性以及揭示纳米材料动态过程（如结晶、相变、蚀刻和运动）方面的独特优势。作者强调，GLC凭借石墨烯的高导电性、热导率和机械柔性等特性，显著克服了传统SiNx液体池的局限性，为研究纳米尺度液相传质、反应中间体和非经典生长路径提供了前所未有的机遇。

　　

2 面纱型GLCs

封装液相溶液并将其与TEM柱的高真空环境隔离，是液相TEM成像的关键。在各种薄膜中，石墨烯因其独特的物理和电子特性而特别适用于液相TEM成像。石墨烯膜由排列成蜂窝晶格的碳原子（Z=6）组成，具有卓越的液体不渗透性和通过范德华力的强大层间粘附力，能有效封装液体样品并防止其蒸发。Yuk等人通过将液体溶液封装在两个石墨烯膜之间，引入了面纱型GLCs。其配置示意图显示，液体样品被密封在两个石墨烯膜之间。石墨烯可以弯曲并贴合液滴，从而实现有效封装。

面纱型GLCs采用直接转移方法制造。通常，通过化学气相沉积（CVD）在铜基底上合成的石墨烯，使用氯化铁（FeCl₃）或过硫酸铵蚀刻溶液进行分离。随后，将漂浮的石墨烯片在去离子水中彻底冲洗数次以去除铜残留物和污染物，然后将其转移到TEM载网上。这种直接转移方法能有效减少对石墨烯片的损伤。后续制造包括将液滴沉积到涂有石墨烯的TEM载网上，然后用额外的独立石墨烯片进行封装。或者，将两个涂有石墨烯的TEM载网与夹在它们之间的液滴组装起来，通过范德华相互作用形成稳定的密封结构。这种设计可容纳各种液体厚度，通常在几十纳米量级。

由于面纱型GLCs使用原子级薄的石墨烯膜作为成像窗口和液体密封膜，它们与微加工SiN_x液体池相比具有明显优势。首先，石墨烯的高电子透明度显著增强了成像对比度，同时与SiN_x膜和非晶碳膜相比，有效减少了电子散射。因此，石墨烯片与没有支撑膜的区域几乎无法区分。其次，石墨烯能有效清除封闭液体介质受电子束照射产生的辐解产物。这些活性辐解产物被石墨烯化学中和，减轻了电子束诱导的损伤。因此，与微加工SiN_x液体池相比，GLCs内的生物分子和其他电子敏感材料表现出更高的稳定性。此外，石墨烯膜具有高的面内热导率和电导率，有助于有效耗散电子束照射积累的热量和电荷。这种能力显著减少了辐解引起的伪影，从而能够更精确地分析固有的纳米级过程。利用石墨烯窗口的优势，GLCs能够对电子束敏感材料（如生物标本和聚合物）进行结构表征。此外，石墨烯固有的机械灵活性使其能够形成大量孤立的液体袋，提供了多个独立的观察区域。这种设计解决了微加工SiN_x液体池中液体腔室数量有限从而限制观察次数的问题。

基于上述优势，纳米晶体的成核和生长路径——广泛用作催化剂和储能材料——已使用面纱型GLCs进行了广泛研究，揭示了超出经典成核理论预测的路径。通常，成核过程由电子束诱导的金属前体还原触发。由于金属原子的高Z对比度，GLCs能够有效跟踪金属包含物种在其成核和后续生长过程中的行为。Yuk等人较早的一项研究揭示了Pt纳米晶生长通过经典的单体逐个附着和纳米颗粒 coalescence（一种非经典生长路径）两种方式进行。这种coalescence通过两种机制发生：1）{111}镜面融合和2）孪晶界形成。

最近使用GLCs的研究进一步揭示了复杂的非经典生长路径，挑战了经典的结晶理论，并为液体中纳米颗粒生长机制提供了新的见解，这得益于原位GLC TEM的高空间和时间分辨率。Yang等人观察到Ni纳米晶结晶路径由非晶中间体介导。不是直接从前体成核，Ni前体最初聚集成非晶中间体，随后在其中形成并生长晶域。非晶中间体向结晶纳米晶的转变有时涉及在单个非晶中间体内形成多个晶域，这些晶域可以通过位错弛豫进一步转变为单晶纳米晶。

类似地，Dachraoui等人确定了在结晶过程中结晶度较低的中间相，称为“团簇云”。这些团簇云在过饱和前体溶液中形成，并表现出较低的结晶特征。重要的是，它们的生长机制不同于经典的单体附着模型；多个团簇云 coalesce 并随后附着到生长的晶体表面，而内在的结构弛豫涉及可逆的单体附着和脱离过程。最终，最初的多晶纳米晶转变为单晶纳米晶，这反映了溶液、晶核和瞬态中间体之间复杂的传质动力学。

此外，通过精确控制反应条件（如前体浓度），亚稳相可以在生长过程中被动力学稳定。Hong等人表明，足够高的氢浓度和有限的Pd前体可用性通过抑制其进一步生长和向热力学稳定的面心立方（FCC）相转变，动力学地稳定了亚稳的六方密堆积（HCP）PdH_x相。在较低的氢浓度和丰富的Pd前体下，FCC相的形成更受青睐。

除了成核和生长过程，各种动态过程，包括蚀刻和纳米颗粒的运动，已使用GLCs直接可视化。有趣的是，蚀刻过程中的形状转变产生了具有不同形态的中间状态。Ye等人研究了金纳米颗粒在水溶液中的氧化溶解，引入FeCl₃作为主要蚀刻剂。电子束照射产生的活性辐解产物引发了纳米颗粒蚀刻。在低FeCl₃浓度的平衡条件下，金纳米颗粒表现出相对较慢的蚀刻速率，允许结构弛豫和稳定的低能晶面形成。相反，在非平衡条件下，一维金纳米颗粒发展出瞬态的尖头形态，表明在快速蚀刻过程中结构弛豫有限。此外，Hauwiller等人表明，在金纳米立方体和菱形十二面体在非平衡条件下转变为具有高指数{hk0}晶面的动力学稳定的四六面体，这些晶面尽管热力学上较不稳定，但在动力学上更有利。

面纱型GLCs通过最小化支撑基底的充电效应，有效实现了对液体中纳米颗粒运动和颗粒间相互作用的观察。Kang等人研究了配体钝化的胶体金纳米颗粒的热运动和coalescence行为。测得的扩散系数小于斯托克斯-爱因斯坦关系所预测的值，尽管电子束的影响可以忽略不计。相反，金纳米颗粒在GLCs的纳米受限液体袋中表现出菲克扩散。此外，纳米颗粒位移分布偏离高斯分布，反映了扩散率的波动。有趣的是，纳米颗粒在扩散接触后形成瞬态复合物，然后发生coalescence。复合物形成后，扩散系数降低，表明流体动力学尺寸增加。这种涉及中间复合物形成的两步coalescence机制比单步直接coalescence路径更准确地解释了实验观察结果。

GLCs的最新进展利用了胶体纳米颗粒在液体中的动态运动来实现原子级3D重建。传统的基于TEM的断层扫描技术可以重建3D纳米晶结构；然而，这些方法存在固有的局限性。具体来说，传统方法依赖于在真空条件下获取图像，直接将纳米颗粒暴露于高能电子束，并且需要大量的样品倾斜，这限制了固定在基底上的纳米颗粒的结构分析。相比之下，高分辨率GLC-TEM通过跟踪纳米颗粒在液体中的布朗运动，能够从多个角度直接成像纳米颗粒结构。这种方法允许从各种纳米颗粒取向获取多个2D TEM图像，从而促进准确的3D重建。

最近的方法学发展进一步推进了这一能力，实现了对纳米晶中原子排列的详细分析以及氧化蚀刻过程中原子级结构演化的实时跟踪。应用于Pt纳米颗粒蚀刻轨迹的毫秒分辨率成像的自监督去噪框架与先进重建算法相结合，能够以3D原子分辨率准确跟踪单个纳米晶的结构演化。值得注意的是，观察到了一个完整的溶解轨迹，揭示了从FCC晶体结构到无序状态的转变，表明无序状态在纳米尺度上的稳定性。原子级重建进一步证明了在表面缺陷位点（如kinks和steps）优先发生蚀刻，同时伴随着结构重排，减少了FCC样对称性，同时增加了HCP样特征。这些发现强调了使用GLCs进行原位液相TEM进行实时原子级结构重建的能力，提供了对纳米级亚稳中间体的见解，这些中间体与体相结构转变中观察到的不同。

此外，GLCs使得能够直接可视化胶体纳米晶上表面配体的动态行为。Pedrazo-Tardajos等人以高成像对比度可视化了吸附在金纳米棒上的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）配体。CTAB配体壳根据液体袋体积呈现不均匀的厚度分布，沿横向面的层明显比纳米棒尖端厚。值得注意的是，CTAB胶束从周围溶液动态附着到晶体表面，突出了表面配体的移动和动态特性，为了解配体-晶体表面相互作用提供了见解。

尽管取得了这些显著成就，面纱型GLCs存在几个局限性。液体袋随机形成，具有随机的尺寸和厚度，需要付出相当大的努力来识别和选择适合研究反应路径的区域。此外，单个口袋之间的液体限制几何形状不一致，以及单个液体口袋内局部液体厚度的显著变化，使定量分析复杂化并降低了观察的可重复性。此外，液体细胞制造过程中由蒸发引起的密封可以显著改变封装溶液的浓度，使其与最初 intended 的值不同。这些挑战推动了最近开发先进GLC构型的努力，以增强对液体封装的控制并实现更高的实验可重复性。

3 井型GLCs

尽管面纱型GLCs通过简单地将液体样品夹在两个原子级薄的石墨烯片之间提供了高成像分辨率和相对简单的制造，但它们在实验可重复性方面表现出局限性。具体来说，液体袋在随机位置形成，表现出其几何构型（包括厚度）的相当大的可变性。这种固有的可变性使液相反应路径的系统性和可重复观察复杂化，因为局部反应条件——如溶液体积和纳米颗粒浓度——可能在个体观察之间显著不同，可能影响反应动力学。因此，需要先进的GLC设计，能够在保持原子级薄石墨烯窗口提供的高空间分辨率和最小背景散射的同时，实现对封装液体的精确几何控制。

井型GLCs因此作为面纱型设计的有效替代方案出现，提供了具有受控体积的明确几何形状的腔室，这显著减少了局部液体厚度和限制的变化，从而为原位液相TEM研究确保了高度可重复的实验条件。在这种配置中，制备具有规则间隔孔阵列的基底，这些孔被称为“井”，通过微加工技术制成。这些井阵列的间隔膜包括SiN_x、六方氮化硼（hBN）或阳极氧化铝（AAO）。在微加工孔阵列之后，石墨烯作为原子级薄的密封膜在间隔物的两侧，形成电子透明和液体不可渗透的窗口。因为石墨烯通过范德华相互作用紧密地粘附在微图案化的间隔膜上，封闭的液体被有效地限制在每个单独的井中，其厚度主要受间隔膜厚度控制。均匀尺寸的井阵列能够在几乎相同的实验条件下对纳米级过程进行多次观察。这种设计与液体袋不规则形成的面纱型GLCs形成对比。液体袋的精确控制几何形状——包括定义的体积、横向尺寸和厚度——促进了可重复的实验观察，并能够对纳米受限液体环境中的反应动力学进行定量分析。此外，每个井的物理隔离确保了一个井中发生的电子束诱导事件或局部环境变化不会影响相邻井中的反应条件。

Rasool等人制造了直径约400 nm、深度200 nm的井型GLCs，封装了数十 attoliters 范围的液体体积。使用聚焦离子束（FIB）进行微图案化打孔。随后，将CVD生长的石墨烯从铜基底上使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为支撑层转移到微图案化的SiN_x膜上以密封液体井。在用硫酸钠蚀刻铜基底后，将石墨烯-PMMA薄膜转移到图案化的SiN_x膜上，随后用丙酮去除PMMA以改善石墨烯-SiN_x粘附。通过将液滴夹在位于SiN_x膜相对两侧的石墨烯片之间，成功形成了封闭的液体井。尽管该方法提供了液体井的明确几何形状并利用了石墨烯窗口的固有优势，但封装的液体在电子束照射10分钟后蒸发或泄漏。这些局限性强调了改进密封技术以防止由于蒸发而泄漏的必要性。

Kelly等人引入hBN膜作为间隔物，具有从100 nm到1.5 μm直径的微图案化井。hBN的厚度可以从几个原子层精确控制到2 μm，从而能够精确调节封装液体的厚度。使用薄而平的hBN膜作为间隔物——通过范德华相互作用与石墨烯表现出强粘附——实现了 robust 的密封和单个井的有效隔离，即使在其他液体井破裂后也是如此。即使在重复原子力显微镜（AFM）测量期间经过26小时的真空暴露，也没有观察到液体泄漏。此外，使用双层或三层石墨烯作为密封窗口显著提高了制造成功率，而hBN固有的高基面热导率促进了有效的散热。因此，在封装水/异丙醇混合物的液体池中，即使在120°C加热时也没有观察到液体泄漏。

Lim等人引入厚度约100 nm的AAO膜作为间隔物，具有有序的纳米孔。纳米孔直径可以从80 nm精确调整到340 nm，从而控制每个单独井中封装的液体体积。在阳极氧化过程中，AAO膜形成了均匀且高度有序的纳米多孔结构，纳米孔在整个AAO膜中同时形成。使用这种方法在3 mm直径的AAO膜内制造了约4.5×10⁷个纳米孔，每个纳米孔作为一个单独的液体井。这种纳米孔密度超过了之前其他井型GLC配置所实现的密度，显著增加了定量和一致分析液相反应机制的机会。此外，通过调节阳极氧化参数可以控制孔径。随后，Bae等人通过将腔室厚度减少到约50-60 nm，进一步推进了AAO集成的GLC设计，平均液体厚度为39.8±11.5 nm。

井型GLC设计——由微图案化的间隔膜和由石墨烯片封闭的孔组成——也已应用于低温电子显微镜（cryo-EM），以实现更可靠的数据采集和可重复的样品制备。尽管cryo-EM对于解析电子束敏感材料的结构非常有效，但传统的样品制备方法通常缺乏对冰厚度的精确控制，这是影响成像分辨率和信噪比的重要因素。过厚的冰层会导致显著的电子散射，因此需要精细控制和均匀的冰层。Kan等人在cryo-EM中使用了井型GLC设计，使用微图案化的SiN_x膜，并用4 nm厚的氧化石墨烯（GO）窗口密封，这些窗口是通过将GO溶液滴铸到图案化基底上制造的。与在传统多孔碳膜网格上制备的样品显示不均匀厚度分布相比，用GO封装的冰层表现出显著增强的厚度均匀性。每个微图案化孔内的冰层厚度控制在约25、58和104 nm，分别与25、50和100 nm的目标厚度精确对齐。这使得能够对生物材料进行可重复和高分辨率的成像。

通过将离散液体体积封装在几何均匀的井中，井型GLCs有助于对纳米级动态过程进行一致的定量分析。Rasool等人揭示了在受限液体井内纳米颗粒的运动。最初，钨纳米颗粒是通过电子束诱导溶液中六氯化钨还原形成的。成核后，纳米颗粒表现出扩散运动，使用时间序列高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）以2.5 s的时间分辨率进行系统跟踪。定量分析涉及约5000次均方位移?x²?作为时间函数的测量，确认钨纳米颗粒遵循由?x²?=4Dt描述的2D布朗运动，其中D代表扩散系数。较大的纳米颗粒表现出比较小对应物更小的D值，表明尺寸依赖的迁移率。值得注意的是，在这些井型GLCs内测量的D显著低于先前报道的微加工SiN_x液体池和体相液体环境中的值。这种降低的迁移率主要归因于纳米颗粒-石墨烯界面、与相邻纳米颗粒的相互作用以及残留的碳氢化合物污染。进一步的分析显示，纳米颗粒生长伴随着纳米颗粒数量的逐渐减少，表明发生了Ostwald熟化和颗粒coalescence。颗粒coalescence通常以纳米颗粒对的形成开始，其特征是在直接接触之前的相关运动。这些纳米颗粒对在合并之前保持一致的质心间距数百秒。

此外，Lim等人通过在均匀电子束条件下跨多个液体井的重复观察，统计研究了金纳米颗粒在液体中的生长和运动。在单独井中观察到的多个纳米颗粒被独立跟踪，确认了布朗运动，其特征是扩散系数范围从1.9×10^?2到9.6×10^?2 nm² s^?1。在早期生长阶段，由于小纳米团簇的连续成核，平均颗粒尺寸最初略有减小。这个阶段随后是由coalescence驱动的颗粒数量减少。这些观察表明，单体附着和颗粒coalescence机制都对胶体纳米颗粒的生长有显著贡献。值得注意的是，重复的多室观察揭示了纳米颗粒扩散系数与颗粒动力学速率（包括生长和溶解）之间的正相关。这种相关性突出了大规模数据收集对于准确阐明纳米级过程的必要性。

定量原位TEM分析进一步为纳米颗粒coalescence过程提供了有价值的见解。仔细考虑表面配体至关重要，因为它们显著调节颗粒间相互作用，从而影响纳米颗粒生长路径。具体来说，颗粒间力——特别是静电相互作用——主要由表面配体控制，强调了理解配体在纳米颗粒coalescence介导的生长过程中的影响的重要性。Bae等人通过检查两个不同的配体系统研究了配体对纳米颗粒coalescence的影响：1）仅用CTAB封端的金纳米颗粒，形成 interdigitated 双层结构，和2）用CTAB和辛胺以3:1摩尔比的混合配体封端的金纳米颗粒。分析了超过40个纳米颗粒对以得出结论。仅用CTAB封端的纳米颗粒表现出逐渐和连续的颗粒间距离减少，表明纳米颗粒逐渐接近coalescence。当达到约1 nm的颗粒间间隙时，纳米颗粒对表现出突然的“跳跃接触”行为。相反，用混合配体封端的纳米颗粒显示颗粒间距离从约3.5 nm突然减少到约1.5 nm。分子动力学（MD）模拟证实了这些实验发现，揭示了辛胺的引入破坏了CTAB的 interdigitated 双层结构的形成，从而显著增强了配体迁移率。这种增加的迁移率有效减少了焓障，促进了快速的纳米颗粒接近和随后的coalescence。

此外，井型GLCs已进一步应用于生物分子的3D结构重建，推进了cryo-EM技术。cryo-EM中过厚的冰层增加了背景电子散射，从而降低了成像对比度。通过精确控制井型GLCs中的冰厚度，冰层厚度被优化到样品的尺寸，确保改善的成像对比度而不影响嵌入生物分子的内在结构。因此，使用控制深度为100 nm、50 nm和25 nm的微图案化芯片，成功识别了生物分子的结构——如HIV-1颗粒（约100 nm）、脱铁铁蛋白（470 kDa）和醛缩酶（157 kDa）。具体来说，脱铁铁蛋白以近原子分辨率（3.06 ?）重建，验证了井型GLC配置对于高分辨率cryo-EM成像的有效性。

尽管在几何明确液体腔室实现的定量表征方面取得了显著进展，但井型GLCs存在固有的结构局限性。首先，石墨烯窗口之间的强范德华力，结合液体和间隔膜（例如，SiN_x、hBN和AAO膜）之间的亲水相互作用，诱导液体优先限制主要在间隔物边缘附近。这种限制形成“环型”液体池，而不是在整个井区域均匀分布的液体层。为了防止环型液体分布的形成，需要精确控制液体腔室的直径（d）和高度（h），其中转变点出现在d/h比为4时。此外，井型GLCs通常一次只封装一种液体溶液，使反应条件的操纵和反应物的引入复杂化。这些限制对原位TEM研究需要操纵反应条件的复杂、多步化学反应路径提出了重大挑战。

此外，井型GLCs制造中涉及的复杂微加工过程——如光刻、湿法蚀刻和FIB铣削——导致制造成本增加。这些复杂的制造步骤可能限制大规模生产和更广泛的可及性。因此，需要进一步的技术进步来开发简便的制造方法并扩展GLC技术的适用性。

4 液体流动型GLCs

液体流动型GLCs构成了原位液相TEM的方法学显著进步，通过将反应物受控引入液体腔室实现反应条件的精确操纵。传统的静态GLC设计，包括面纱型和井型GLCs，将预加载的液体样品限制在两个石墨烯片之间，固有地限制了外部化学品的按需添加。因此，这些静态设计主要将观察限制在由电子束照射触发的反应。此外，静态GLC配置需要在样品制备期间预加载和预混合所有反应物，因此阻止了初始反应阶段的实时观察。

微加工SiN_x液体池集成了流体通道，设计用于通过化学添加调节化学环境，显著扩大了原位TEM研究可及的反应范围。将流体通道集成到液体腔室中促进了溶液组成的实时修改，并通过腔室与外部入口之间的连接连续循环溶液延长观察时间，从而减少了辐解诱导副产物的积累。此外，这种连续液体流动有效减轻了气泡积累，保持了稳定的成像条件。然而，尽管有这些优点，SiN_x液体流动型池表现出由于通常几十纳米厚的膜的局限性。这些相对较厚的成像窗口不可避免地增加电子散射并引起显著的充电伪影，对高分辨率成像提出了相当大的挑战。液体流动型GLCs通过利用原子级薄的石墨烯膜作为成像窗口直接解决了这些问题，提供了优异的电子透明度、电子照射下最小的充电效应以及活性辐解产物的清除效应。因此，与基于SiN_x的液体流动型池相比，石墨烯膜增强了液相TEM中可实现的空