综述：热致发光可用于研究光合生物中的脂质过氧化

本综述系统阐述了热致发光（HTL）技术在光合生物脂质过氧化研究中的创新应用。相较于传统硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法，HTL技术通过检测高温下脂质过氧化终产物（如丙二醛（MDA））激发态能量向叶绿素的转移所发射的发光信号（HTL2 band, 115-130°C），实现了对光合膜脂质过氧化过程的非侵入式、高灵敏度、连续监测。该技术为研究氧化胁迫（如强光、低温、营养缺乏）对光合机构的影响提供了强大工具。

　　

Lipid peroxidation

活性氧（ROS），如超氧化物、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，是分子氧参与代谢过程的副产物。这些高反应活性物质会攻击并降解细胞内的脂质、蛋白质和核酸等组分，最终导致细胞死亡和组织损伤。由ROS直接或间接引发的一个主要过程是脂质过氧化，该过程在富含多不饱和脂肪酸（PUFAs）的膜系统（如叶绿体膜）中尤为显著。在光合生物中，类囊体附近会产生大量氧气，这些氧气易被强大的氧化还原系统转化为有害的超氧化物，并生成可触发脂质过氧化反应的单线态氧。

脂质过氧化是指活性氧化剂（包括ROS）攻击具有碳-碳双键的脂质，导致碳原子上的氢被抽提、氧插入，并形成脂质过氧自由基和氢过氧化物的过程。整个过程包含三个步骤：引发、传播和终止。在引发步骤，羟基自由基等促氧化剂会抽提烯丙基氢，形成碳中心的脂质自由基（L·）。在传播阶段，脂质自由基（L·）迅速与氧气反应生成脂质过氧自由基（LOO·），后者再从另一个脂质分子夺取氢原子，形成新的脂质自由基（L·）和脂质氢过氧化物（LOOH），从而维持链式反应。在终止反应中，维生素E等抗氧化剂向LOO·自由基提供一个氢原子，形成相应的维生素E自由基，该自由基随后与另一个LOO·反应生成非自由基产物。一旦脂质过氧化启动，链式反应将持续进行直至终止产物生成。

膜脂最终被脂质过氧化破坏，产生多种分解产物，其主要初级产物是脂质氢过氧化物。多种不同的醛类，如丙二醛（MDA）、丙醛、己醛和4-羟基壬烯醛（4-HNE），可作为次级产物被生成。其中MDA的诱变性最强，而4-HNE的毒性最高。

Assay methods for lipid peroxidation

脂质过氧化通常通过评估其某些次级产物（如MDA、4-HNE或其他羰基化合物）来识别和测量，或通过直接检查主要初级产物（脂质氢过氧化物）的水平来实现。测定脂质氢过氧化物的方法简单且成本低廉，但其在活体生物中的实际应用可能受限于这些分子的短寿命，且其灵敏度低于对次级产物的测量。

硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定是最常用于确定脂质氧化的测试方法之一。该方法通过使MDA与硫代巴比妥酸反应生成一种呈粉红色的产物，可使用可见光或荧光分光光度计进行测量。TBARS测定法简单、重现性好且成本低。但该测试并非脂质过氧化的特异性鉴定方法，因为MDA还有其他来源。由于TBARS能检测多种脂质分解产物（即硫代巴比妥酸反应物质），该测试对MDA缺乏特异性。此外，TBARS测试并不完全适合体内测量MDA，因为蔗糖、抗坏血酸和脱氧核糖的氧化产物可与TBARS反应形成加合物，其吸收光谱与MDA相似。另外，MDA易被代谢，导致其在体内的半衰期非常短。

目前已开发出用于分析MDA和其他次级或初级氧化产物的替代色谱技术。高效液相色谱（HPLC）联用可见光（HPLC-UV/Vis）或荧光（HPLC-FL）检测，以及配备质谱的气相色谱，是测量脂质过氧化的极其灵敏和具有区分能力的方法，但它们所需的时间明显长于TBARS测定，且设备成本高得多。

通常，MDA和4-HNE等脂质过氧化次级产物会引起蛋白质修饰，可通过蛋白质免疫印迹和免疫测定方法进行分析和量化。用于鉴定MDA和4-HNE蛋白质加合物的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术已发展为检测脂质过氧化的先进方法。然而，这些化学方法在微生物中常规用于脂质氧化评估是不切实际的，因为分析需要大量的生物材料，且耗时，不适合高通量测试。

由于某些脂质过氧化产物（如¹O₂和激发态羰基化合物）会发光，因此可以使用化学发光技术体内追踪氧化应激。低强度光子发射已成为动物科学领域追踪氧化应激的常用技术。多项研究表明，这种发光信号与其他脂质过氧化指标相关，从而验证了低水平化学发光可用于测量脂质过氧化损伤的观点。化学发光方法为氢过氧化物的定量测定提供了灵敏、快速和简单的分析手段，并且与其他吸收技术相比具有更高的灵敏度。

电子顺磁共振（EPR）和核磁共振（NMR）波谱已广泛用于测量脂质过氧化的初级和次级产物。EPR自旋捕获是一种分析和检测脂质氧化过程中产生的短寿命自由基的分析技术，这些自由基很少能被直接检测到。NMR波谱是研究脂质过氧化的非常有用的技术，因为它可以研究起始物质的变化以及氧化产物在此过程中的演变。然而，这两种技术都需要非常昂贵的设备。

在共聚焦显微镜方法中使用荧光染料/探针是可视化活细胞中脂质过氧化的强大工具。这些组合技术能够以高灵敏度和选择性检测脂质氢过氧化物，并提供关于过氧化在细胞病理学中可能作用的非常有价值的信息。

基于热致发光的技术已被提出作为识别光合生物中脂质过氧化的有用方法。将含叶绿素的材料逐渐加热到70°C以上通常会导致叶绿素发光发射增加。在高温下观察到的发光强度增强被称为高温热致发光（HTL）。脂质过氧化物的热分解导致形成三重态羰基物种，随后激发能向叶绿素分子迁移，叶绿素在返回基态时以发光形式释放能量。

在过氧化脂质的热分解中，会产生一个以约130°C为中心（HTL2 band）的宽HTL带。HTL2带的强度与通过常规方法测定的不同脂质过氧化产物的浓度有很好的相关性。研究表明，HTL2峰的强度与经历氧化应激的藻类、叶片和类囊体中存在的MDA量有关。该带的强度与用真菌激发子处理的烟草叶片中TBARS的量也显示出相关性。

HTL技术提供了对过氧化物浓度的区分性和灵敏追踪，可能解决传统脂质过氧化检测技术相关的一些问题。它是一种简单、廉价且非侵入性的方法；不需要添加外部探针，并提供非常灵敏和连续的过氧化物水平监测。此外，该技术只需要使用少量生物材料。在未来的研究中，HTL技术有可能在光合生物中用作快速筛选方法，然后再使用更复杂或耗时的技术。

Photosynthetic thermoluminescence

先前照射过的固态材料在黑暗中在特定温度下加热时会发生光发射。这种现象称为热致发光（TL），可在许多天然矿物和人工创造的固态（包括半导体、有机固体和金属有机化合物）以及复杂生物系统（如光合装置）中观察到。在固体中，暴露的电子和空穴可以分离并陷入能量阱中，通过辐射或非辐射过程复合的概率非常低。当温度升高时，热能可能变得足以让电子和空穴从陷阱中逃逸并复合。当通过辐射过程发生时，样品将开始发光，并随着温度升高持续发光，直到陷阱被清空。

1957年，Arnold和Sherwood首次记录了绿色植物材料中的TL现象。基于对叶绿体延迟发光的观察，他们提出部分吸收的光能以长寿命、高度稳定的陷阱状态存储在光合装置中。这种发光称为延迟发光（DLE），源于光系统II（PSII）中叶绿素荧光，是由先前光分离的电荷对复合产生的。光化学分离的电荷对由于阻止电荷复合的活化能势垒而稳定在PSII上。电荷复合通过多种途径发生，其中一种途径导致在叶绿素天线中以相对较低的效率再生激子，并有以荧光形式失活的可能。

光产生的 precursor 电荷对可以在低温下稳定；随后在黑暗中加热会导致DLE，这通常被称为热致发光（TL）或热刺激延迟发光。TL技术包括在足够低的温度下照射样品以最小化所研究电荷对的复合速率后，记录样品升温过程中的发光发射。

TL技术能够通过逐步升温过程中连续的发射带识别PSII中各种类型的电荷对。在分离的光合膜和完整系统中，经过一系列短闪光后，可观察到在约25°C达到峰值的B带TL。该发射是由S₂/S₃Q_B^-对复合引起的。用抑制PSII的除草剂（如敌草隆或莠去津）处理，可阻断电子从Q_A向Q_B的传递，导致形成在约5°C达到峰值的Q带，该带由S₂Q_A^-复合引起。在特定条件下也可检测到约55°C的C带。该TL带由D⁺Q_A^-复合引起，其中D⁺是PSII无活性支路上酪氨酸D的氧化形式。

一种特殊类型的发光发射，称为“余辉”（AG），通常在完整光合材料经远红光照射后获得。AG发射与预照射后立即处于S₂/S₃Q_B非辐射状态的PSII中心部分有关，其中从基质通过循环或呼吸途径传递来的电子的到达导致形成S₂/S₃Q^-辐射状态，从而发射发光。通过线性温度梯度，该发射可以以在约45°C达到峰值的尖锐TL带被最佳记录。

High temperature thermoluminescence in photosyntetic organisms

除了光合作用中电子转移反应的可逆过程外，其他过程也会在加热含叶绿素的样品时导致发光。多个研究组报道了60°C以上的高温热致发光带，这些发光并非源于PSII氧化还原组分的电荷复合，而很可能源于脂质过氧化产物向叶绿素的能量转移。

Arnold和Sherwood最初在照射过的干燥类囊体中的叶绿素里记录到一个在125°C达到峰值的高温TL发射。含叶绿素的材料在加热到70°C以上（无需预先光照）时，其发光发射会增强。这种在高温下增强的发光强度被称为高温热致发光或HTL。这种类型的TL在与叶绿素荧光和PSII发光相同的650-750 nm光谱范围内发射，但其发生与预先光照无关。HTL发射与光合作用没有联系，例外的是，被黑暗激发的叶绿素作为红光光谱中的发光发射体。

在光合材料经过氧化应激处理后，已识别出两种不同类型的高温HTL带，其峰值温度分别在75°C/90°C或115°C/140°C。一个约73°C的HTL带被归因于膜破坏导致的叶绿素化学发光。Hideg和Vass也描述了一个在75°C达到峰值的带，由分离的菠菜叶绿体经氧化处理产生。它被认为是高温下分子氧与光合膜之间温度增强的相互作用的结果，可能涉及暴露于高温期间的膜脂质过氧化。在用真菌激发子处理的烟草叶片和绿化大麦叶片中也发现了类似的带。当以每分钟30°C的速率加热时，该带显示最高温度为90°C；当以每分钟3°C的速率加热时，显示最低温度为70°C。

大约1990年，莫斯科大学的研究人员在经历氧化应激的藻类或叶片中观察到60°C以上的HTL带，主带在130°C。Vavilin和Ducruet表明，导致膜脂质氧化损伤的处理会产生三个HTL带：一个小的60-75°C带（HTL1 band），一个在115-130°C峰值显著上升的带（HTL2 band），以及另一个150°C以上的带（HTL3 band）。这些作者的工作清楚地表明，发射带的类型取决于样品的水分含量。HTL1带仅在潮湿条件下观察到。要将此带转换为HTL2带，需要在测量前对样品进行脱水并在干燥的分析环境中进行。当样品置于标准TL设置中的干燥气氛（液氮在密封环境中充当干燥剂）中时，HTL2带可见。相反，如光合TL研究中通常所做的那样，在水介质中将样品（叶绿体、藻类、叶片方块）加热至100°C以防止干燥，则仅在约75°C出现一个带。HTL3带（跨越151-158°C）的性质仍不清楚。氮气抑制了该带，该带在类囊体的强光处理过程中保持稳定，而此期间发生了脂质过氧化。因此，该带似乎与脂质过氧化产物的热解无关，而可能是由叶片化合物的热诱导自氧化引起的。

在特定的拟南芥（Arabidopsis thaliana）和菜豆（Phaseolus vulgaris）生物型中，即使没有初始光照，也识别出一个在约65°C达到峰值的不同热致发光带。该带被低于负成核点的冷冻温度或用氮气替换TL池中的空气所抑制，这表明了氧化机制和区室化的作用。这种热化学发光发射可被视为HTL1发射，可能源于拟南芥和菜豆中某些化合物的辐射氧化。

Origin of the HTL2 band

多不饱和脂肪酸经历链式氧化反应，形成环过氧化物。Vavilin和Ducruet提出HTL2带源于脂质环过氧化物的热分解，因为它在用活性氧物种淬灭剂、自由基清除剂处理或用氩气替换氧气后保持不变。在未覆盖的叶片样品中观察到的HTL2带在用氮气吹扫腔室后并未减少，表明过氧化物不是在升温过程中形成的，但在样品保持湿润时消失，表明脂质过氧化物在发生辐射热解之前就已水解。因此，在潮湿条件下记录的HTL1带是一个伪带，是辐射热解和热增强非辐射水解之间竞争的结果。

高温刺激的脂质环过氧化物分解导致形成三重态激发态的羰基化合物，如MDA。激发的羰基分子迅速将能量转移给叶绿素分子，叶绿素在返回基态时将其以发光形式释放。Cilento及其同事证明，三重态羰基的能量可以有效地转移给叶绿素。酪氨酸（三重态物种的有效淬灭剂）导致HTL2带强度显著降低的观察表明了三重态羰基参与TL发射。HTL2带的出现可以排除是由LOO·和（或）LO·自由基之间的相互作用引起的，因为许多外部自由基清除剂无法降低预照光类囊体中的HTL强度。这些作者还提出，氢过氧化物的分解不能解释HTL2发射。

Instruments for high temperature thermoluminescence

所有报道的HTL测量均使用在同一实验室制造的设备进行。尽管有一家公司（Photon Systems Instruments PSI，捷克共和国）生产可用于HTL测量的商业TL仪器。自制设备在很大程度上共享相同的基本原理。本质上，一个设置应具有一个可以冷却和加热并控制温度的样品架，一个能够精确测量样品温度的温度传感器，以及一个红敏光电倍增管（最好是端窗型）和一个高压电源。

这里描述的是由Jean-Marc Ducruet博士为植物生物化学和光合作用研究所（塞维利亚大学和CSIC）开发的一种定制设备，用于测量标准（0-85°C）和高温（20-160°C）范围内的热致发光。

通过专用软件，使用National Instrument DAQ-Pad1200接口，由PC计算机控制温度调节和信号记录。样品池包括一个直径2 cm的水平腔室和一个基底铜膜。一个Thermocoax电绝缘电阻加热器（法国）由一个可变（0至5A）的计算机控制电源供电，并放置在腔室下方用于温度控制。一个自制功率放大器通过向额定最大40 V和5 A的电阻加热器提供可变电流（或电压）来控制温度。位于滤光片和加热元件之间的热电偶用于调节温度。使用日本的Hamamatsu H5701-50光电倍增管模块检测发光发射。发光通过一个高通Schott RG 645滤光片（对大于670 nm的波长有最大透射率）过滤，然后通过光导聚焦到光电倍增管上，以防止在高温液体测量期间光电倍增管窗口受热。数据采集、信号分析和图形模拟按先前描述的方法进行。

用于HTL测量的藻类或蓝细菌细胞悬浮液使用0.22 μm纤维素酯膜或一片0.45 μm Whatman滤纸过滤。然后，将脱水细胞悬浮液放在样品池上，并用金属垫圈压紧以确保与电阻加热板的热接触。将叶盘样品放入样品池时，可通过将金属网格压在叶片上或将叶盘粘在电子学中常用的铝或铜粘合片上来实现。这可以防止样品在100°C以上因干燥而萎蔫或弹出。在实验前和实验期间用N₂气体吹扫样品15分钟，以使样品干燥并防止高温引起的氧化。将样品在20°C黑暗中孵育10分钟，随后在以每秒0.1°C的速率从10°C加热到160°C时记录发光发射。在升温过程中应小心防止样品被窗口覆盖，并允许其干燥。

HTL2 band as a sensitive indicator of plant stress

HTL技术已被用于研究经历各种非生物胁迫条件的光合生物中的体内脂质过氧化。在缺乏功能性紫黄质脱环氧化酶的拟南芥突变体npq1中研究了紫黄质循环的防御特性。HTL检测到的脂质过氧化在npq1中比在其野生型对应物中更显著。冷胁迫显著增加了脂质过氧化，最终导致npq1的光氧化损伤，从而引起叶片白化和组织坏死。结果表明，紫黄质循环通过多种机制保护类囊体膜脂质免受光氧化。

使用HTL和荧光测量评估了三种缺乏生育酚（维生素E）的chlP转基因烟草品系的光耐受性。暴露于强光和低温导致PSII活性迅速降低，随后延迟约4小时出现脂质过氧化。该现象在缺乏生育酚的叶片中变得更强烈。结果表明，生育酚通过脂质过氧化保护类囊体膜免受光破坏。

使用不同的光谱方法研究了抗莠去津大豆细胞系STR7的光合异常，该细胞系在编码PSII的D1蛋白的叶绿体psbA基因中存在单个S268P突变。HTL2带的分析表明，与WT细胞相比，STR7细胞中的脂质过氧化显著增加。作者提出，STR7系中的突变导致PSII复合体中从Q_A到Q_B的电子传递减慢，从而增加了单线态氧形成的可能性，这可能引发类囊体膜中的脂质过氧化。

研究了在光呼吸或非光呼吸条件下生长的百脉根（Lotus japonicus）Ljgln2-2光呼吸突变体植株的HTL发射。在非光呼吸条件下生长的WT和Ljgln2-2突变体两种植株的HTL2带强度均显著高于在光呼吸条件下生长的植株。这些发现表明，当光呼吸被抑制时，叶绿体脂质的过氧化增加，并暗示光呼吸提供了针对光诱导脂质过氧化的保护。

Vavilin和Ducruet报道，涉及低温和强光的处理会诱导细胞膜脂质的氧化损伤，导致出现小的HTL1带和HTL2带强度的显著增加。在黑暗中显著脱水的挪威槭（Acer platanoides）和欧洲七叶树（Aesculus hippocastanum）叶片显示，在120°C时叶绿素化学发光峰显著上升，这与叶绿体膜中脂质过氧化产物的积累有关。

HTL技术也用于检查藻类对营养缺乏的光合响应。在低光强度下铁缺乏条件下生长的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）细胞中观察到高脂质过氧化水平。这些结果表明，铁缺乏可能引发受体侧的光抑制过程，并随后在通常不具有光抑制性的极低光强度下导致单线态氧的产生。Vavilin等人发现，当小球藻（Chlorella (C.) pyrenoidosa）在氮或磷短缺且光照水平中等的条件下培养时，HTL会升高。当C. pyrenoidosa或其他物种在营养丰富的培养基中培养时，即使暴露于强光，HTL发射也保持较低水平。因此，营养可用性对于细胞抵抗光诱导膜脂质过氧化可能至关重要。

HTL技术也被用于评估某些生物胁迫对植物的影响。烟草（Nicotiana benthamiana）感染胡椒轻斑驳病毒导致HTL2带显著上升。病毒感染诱导的细胞代谢变化，如卡尔文循环功能受损，可能有助于氧化应激的发展。Stallaert等人发现，用真菌激发子隐地蛋白处理烟草叶片导致HTL带强度显著上升。这些结果表明，隐地蛋白在叶绿体内触发活性物种的形成，可能参与脂质过氧化过程。

HTL测量有利于研究天然浮游植物群落中脂质过氧化的重要性。在对应于最大叶绿素发射（670-680 nm）的红光光谱部分选择性检测HTL，可以清楚地区分含叶绿素的光合生物产生的发光与不含叶绿素的颗粒物发出的化学发光（后者通常表现为相对于叶绿素发光蓝移）。Vavilin等人报道，浮游植物中脂质过氧化反应的强度受光强度日变化的影响。但对在不同地点采集的浮游植物HTL日动态的比较表明，光强度并非导致细胞内脂质过氧化物含量上升的唯一因素。

HTL技术也已应用于使用光合物种对某些化学品进行毒理学评估。使用该技术研究了六种环境化合物对小球藻（Chlorella vulgaris）细胞的影响：作为化学中间体的溴苯和二乙醇胺，作为抗氧化剂的没食子酸丙酯，作为半导体材料的硝酸铟，作为农药的氟乙酸钠，以及作为抗疟药的氯喹。HTL2带的分析显示，在与四种测试化学品（溴苯、氟乙酸钠、二乙醇胺和氯喹）孵育后，小球藻光合膜中存在高度脂质过氧化。当将单细胞绿藻C. pyrenoidosa的培养物暴露于10 μM的氧化应激促进剂甲基紫精5小时时，检测到在120-130°C的热致发光上升。此外，Horcsik等人发现，Cr(VI)引起的C. pyrenoidosa中D1蛋白的光破坏导致氧化应激和脂质过氧化增强，这由HTL2带的出现所证明。

HTL bands in cianobacteria

只有少数研究使用HTL技术研究蓝细菌中的脂质过氧化。将集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）细胞与甲基紫精（一种促进膜脂氧化的除草剂）孵育，导致HTL2带振幅显著增加，并还在约60-75°C触发热致发光。HTL技术也被用于研究PSII中细胞色素b559突变对嗜热蓝细菌Thermosynechococcus elongatus功能的影响。具有aR18S突变的细胞在正常条件下培养而未发生光抑制时，显示出高水平的脂质过氧化。该突变可能改变细胞色素b559与Q_B或质体醌池的相互作用，导致高浓度的Q_B^-，这可能增加高度反应性和有毒物种¹O₂形成的可能性。这可能引发光合膜中不饱和脂质的过氧化。