短链羧酸作为碳源对四种PHA生产菌生长动力学及抑制特性的系统性研究

本研究针对短链羧酸作为PHA生产底物时存在的微生物生长抑制问题，系统评估了Cupriavidus necator、Pseudomonas putida、Azohydromonas australica和Haloferax mediterranei四种常用PHA生产菌在甲酸、乙酸、丙酸、戊酸和乙酰丙酸上的生长特性。通过Han-Levenspiel抑制动力学模型量化了各羧酸的半数抑制浓度(IC50)，发现乙酸和乙酰丙酸是最适生长底物，而甲酸和戊酸表现出较强抑制作用。研究为优化PHA生物生产工艺提供了关键动力学参数和底物选择策略。

　　

在追求可持续材料解决方案的浪潮中，聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为一种完全生物降解的聚合物，正成为替代传统塑料的理想选择。这类由微生物合成的生物聚酯不仅能够通过生物质废弃物转化实现循环生产，还展现出优异的材料性能。特别是短链羧酸——这些来自有机废弃物厌氧消化或热解处理的低成本中间体，直接作为PHA生物合成的前体物质，为降低生产成本和提高可持续性提供了新途径。

然而，短链羧酸对微生物细胞的毒性效应一直是制约其工业化应用的瓶颈。这些酸类物质能够穿透细胞膜，破坏细胞内pH平衡，抑制ATP生成，最终导致微生物生长受阻。尽管先前研究报道过个别PHA生产菌利用羧酸的现象，但缺乏系统性的生长动力学分析和抑制特性评估，使得工艺优化缺乏理论依据。

为此，研究人员在《Microbial Cell Factories》发表了针对四种典型PHA生产菌的生长特性研究。他们采用微型生物反应器系统，通过自动监测背向散射光强度(λ_Ext=660 nm)和溶解氧参数，量化了Cupriavidus necator H16、Pseudomonas putida KT2440、Azohydromonas australica DSM 1124和Haloferax mediterranei DSM 1411在六种短链羧酸上的最大比生长速率(μ_max)和延滞期时长。研究运用Han-Levenspiel抑制动力学模型分析数据，确定了各羧酸的半数抑制浓度(IC₅₀)和最优生长浓度范围。

关键技术方法包括：使用48孔板BioLector微型生物反应器系统进行高通量培养；通过背向散射光强度监测生物量变化；应用Han-Levenspiel模型拟合生长抑制动力学；采用Baranyi方法计算延滞期；所有实验均设生物学三重重复。

甲酸作为碳源

研究发现甲酸的利用存在显著菌种差异性。

仅Haloferax mediterranei能够在高达10.4 g·L^-1的甲酸浓度下生长，最大比生长速率达0.104±0.003 h^-1，IC₅₀为5.6 g·L^-1。其余三种菌均未显示显著生长。一个有趣的现象是：C. necator虽无生长迹象，但其培养液pH值上升，暗示可能存在甲酸代谢活动但不足以支持生长繁殖。

乙酸作为碳源

乙酸是所有测试羧酸中耐受性最好的底物。

所有四种微生物都能利用乙酸生长，其中H. mediterranei表现最佳(μ_max=0.142±0.002 h^-1)，其次为C. necator(0.102±0.005 h^-1)。C. necator展现出最宽的最适生长浓度范围(0.95-10.5 g·L^-1)和最高IC₅₀值(10.5 g·L^-1)，表明其对乙酸具有优异耐受性。A. australica生长速率最低(0.021±0.002 h^-1)，可能与三羧酸循环(TCA循环)功能受损有关。

丁酸作为碳源

H. mediterranei和P. putida在丁酸上表现最佳，最大比生长速率分别为0.121±0.004 h^-1和0.114±0.007 h^-1。与乙酸相比，两种菌对丁酸的耐受性降低，IC₅₀分别降至3.3 g·L^-1和3.6 g·L^-1。C. necator虽然生长速率较低(0.080±0.001 h^-1)，但耐受性更高(IC₅₀=5.2 g·L^-1)。A. australica仅能在极低浓度(0.4 g·L^-1)下微弱生长，实际应用价值有限。

3-HV前体酸：丙酸、戊酸和乙酰丙酸

这三种酸是合成PHBV共聚物中3-羟基戊酸(3-HV)单体的直接前体，对改善PHA材料性能至关重要。

丙酸利用：

P. putida和H. mediterranei在丙酸上获得最高生长速率(0.16±0.02 h^-1和0.18±0.005 h^-1)，显著高于其在乙酸上的表现。C. necator生长速率较低(0.073±0.003 h^-1)，而A. australica无生长。C. necator和H. mediterranei对丙酸的IC₅₀均为6.7 g·L^-1，P. putida耐受性较低(IC₅₀=3.8 g·L^-1)。

戊酸毒性：

戊酸是测试中最毒的3-HV前体，C. necator和H. mediterranei的最高生长速率仅0.093±0.003 h^-1和0.09±0.02 h^-1，IC₅₀分别为3.9 g·L^-1和2.7 g·L^-1。P. putida生长速率更慢(0.077±0.003 h^-1)，浓度超过5 g·L^-1时生长完全抑制。

乙酰丙酸优势：

乙酰丙酸对C. necator和P. putida毒性低于戊酸。P. putida获得最高生长速率(0.16±0.01 h^-1)，最适浓度范围1.8-9.6 g·L^-1。C. necator不仅生长速率较高(0.11±0.01 h^-1)，且最适浓度范围更宽(0.9-14.0 g·L^-1)，IC₅₀达14 g·L^-1，是戊酸的三倍。H. mediterranei生长速率达0.097±0.002 h^-1。

羧酸疏水性与毒性的相关性

研究揭示了羧酸疏水性(通过log P值量化)与毒性(IC₅₀)间的负相关关系。

疏水性较高的羧酸(如戊酸，log P=0.28)通常毒性更强，IC₅₀值更低。例外的是甲酸(log P=-0.54)，虽亲水性最强但毒性显著，这与甲酸抑制芳香族氨基酸生物合成的特殊机制有关。乙酰丙酸因较低疏水性(log P=-0.49)而成为毒性最低的3-HV前体。

羧酸对延滞期的影响

高羧酸浓度显著延长延滞期，

这对工业发酵效率产生重要影响。例如C. necator在2.2 g·L^-1丁酸中延滞期为12±2 h，而在6.6 g·L^-1时延长至126±32 h。研究表明，即使微生物能在高浓度底物下生长，过长的延滞期也会大幅增加总发酵时间，影响经济性。

微生物特性讨论

A. australica在大多数羧酸上无生长，与其受损的TCA循环和依赖乙酰辅酶A溢流代谢的特性一致。虽然文献报道该菌能利用羧酸合成PHA，但生长能力有限。

P. putida能利用除甲酸外的所有测试羧酸，但微型生物反应器中的生长速率低于传统生物反应器数据，可能与系统差异有关。

C. necator对羧酸表现出最广的耐受范围，特别是在乙酰丙酸上14 g·L^-1的IC₅₀值令人印象深刻。其在戊酸上的生长能力与文献报道的矛盾，可能源于先前研究未观察到长延滞期后的生长。

H. mediterranei能利用所有测试羧酸，但其高盐培养基要求(200 g·L^-1 NaCl)增加了工业应用的复杂性和成本。

研究结论强调，短链羧酸作为PHA生产底物的可行性高度依赖于微生物菌种和羧酸类型的匹配。乙酸和乙酰丙酸是综合性能最优的底物，平衡了生长速率和耐受性。C. necator和H. mediterranei展现出最宽的底物适应范围，而A. australica几乎无法利用羧酸生长。羧酸疏水性与毒性的相关性为底物选择提供了理论预测依据。

该研究的系统动力学数据为设计高效PHA生产流程提供了关键参数，特别是在底物浓度控制、菌种选择和过程优化方面。研究结果推进了基于废弃物的生物聚合物生产向工业化应用迈进的步伐，为可持续材料制造提供了科学基础。