基于高度简并引物的分子工具开发用于检测和分类细菌中四大类聚羟基脂肪酸酯合酶(phaC)基因

本研究针对现有引物组无法全面覆盖四大类phaC基因、缺乏简并性设计及实验验证不足的问题，开发了九对高度简并引物，通过HYDEN工具设计和De-MetaST-BLAST验证，成功检测了已知菌株和15株海洋细菌中的phaC基因，并通过发酵实验和NMR证实了PHA生产能力，为高效筛选PHA生产菌提供了可靠分子工具。

　　

在塑料污染日益严重的今天，传统石油基塑料的不可降解性给全球环境带来了巨大压力。每年有超过80亿公吨的塑料被生产，其中聚乙烯(PE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚氯乙烯(PVC)等材料因寿命短、回收困难，造成了严重的废弃物积累问题。尽管填埋、焚烧和回收等方法被广泛采用，但这些方法存在温室气体排放、微塑料生成和降级回收等局限性。为了应对这一挑战，寻找环境可持续的替代品已成为当务之急。

聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为一种由古菌和细菌合成的天然聚合物，因其生物可降解性和生物相容性而备受关注。近年来，海洋细菌因其抗污染性、低温生长能力和快速增殖特性，成为PHA生产的新兴资源。PHA在细胞内作为碳和能量储存分子存在，可达细胞干重的90%，并包含约140种不同的羟基脂肪酸。其中，聚3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)和聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)(PHBHHx)等类型被广泛应用于包装薄膜和3D打印等领域，同时在心血管、神经组织工程和伤口愈合等医疗植入领域也展现出潜力。然而，PHA的生产仍面临高成本、低产量和不稳定产品质量等挑战。

PHA合成酶(phaC)基因编码的PHA合酶在PHA聚合过程中起关键作用。根据基因座组织、底物偏好和酶亚基组成，phaC基因被分为四大类（I、II、III和IV），每类具有独特的特征和底物特异性，决定了PHA聚合单体的类型。类I常见于Azotobacter chroococcum等菌株，其基因座包含酮硫解酶(phaA)、脱氢酶(phaB)和合酶(phaC)；类II主要存在于Pseudomonas species，操作子包含两个PHA合酶基因(phaC1和phaC2)和一个解聚酶基因；类III发现于Bacillus thuringiensis等菌株，负责短链PHA生产；类IV最早在Priestia megaterium（原Bacillus megaterium）中发现，由编码异源亚基的phaR和phaC基因组成。随着商业兴趣的增加，全球PHA产量预计到2026年将达到760万公吨，因此寻找新型PHA生产菌株具有重大意义。

当前，细菌PHA筛查常用方法包括苏丹黑B、尼罗蓝A和尼罗红等染色技术，以及傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和聚合酶链反应(PCR)方法。然而，许多现有引物组存在局限性：仅针对 well-studied 属（如Pseudomonas和Cupriavidus）、缺乏实验验证、简并性不足无法覆盖phaC序列多样性，且未能靶向所有四大类phaC基因。这些问题限制了其在广泛环境样本中的应用。

为了克服这些限制，研究人员在《Microbial Cell Factories》上发表了一项研究，开发了一种基于高度简并引物的分子筛查工具，用于检测和分类细菌中的四大类phaC基因。该研究通过计算和实验验证，确保了工具的可靠性和广泛应用性。

研究采用的关键技术方法包括：使用HYDEN工具设计高度简并引物，利用De-MetaST-BLAST进行 in silico 验证引物特异性，通过PCR扩增和凝胶电泳检测phaC基因，结合16S rDNA测序鉴定新型海洋细菌（样本来源于英国沿海沉积物，包括Weymouth、Port William、Montrose、Holy Island和Bristol等地），并通过摇瓶培养和核磁共振(NMR)分析验证PHA生产能力。

结果

Development of degenerate primers using HYDEN tool for the detection of phaC genes

研究人员使用HYDEN工具设计了九对简并引物，覆盖65个类I、10个类II、19个类III、30个类III/IV和6个类IV phaC基因序列。这些引物具有不同的简并度和覆盖范围，例如phaCF1/phaCR1引物对覆盖77%的类I phaC基因。通过优化引物参数，确保了其广泛适用性。

In silico validation of degenerate primers using De-MetaST-BLAST tool

利用De-MetaST-BLAST工具对引物进行 in silico 验证，结果显示五对引物（phaCF1/phaCR1、phaCF3/phaCR3、phaCF5/phaCR5、phaCF8/phaCR6和phaCF8/phaCR8）能特异性扩增目标phaC序列，而高简并度引物如phaCF2/phaCR2和phaCF4/phaCR4则出现非特异性匹配。这表明简并度需精确控制以平衡覆盖范围和特异性。

In vitro validation of degenerate primers using prototype strains

通过已知PHA生产菌株（如Azotobacter chroococcum、Pseudomonas mendocina、Bacillus thuringiensis和Priestia megaterium）进行体外验证，五对短listed引物成功扩增出预期大小的片段，测序确认其与NCBI数据库中phaC基因高度相似（97-100%）。这证实了引物的实验可行性。

Screening of a novel marine bacterial strains for phaC gene and PHA biosynthesis

应用最终四对引物（phaCF1/phaCR1、phaCF3/phaCR3、phaCF5/phaCR5和phaCF8/phaCR8）筛查15株新型海洋细菌，发现七株（Halomonas alkaliphila DINO、Marinobacter sp. MB2、Halomonas profundus NQ7、Halomonas titanicae MC2、Bacillus pacificus C4、Bacillus pacificus B4和Bacillus mycoides B12）phaC阳性。通过摇瓶培养，这些菌株在营养限制条件下生产PHA，其中Halomonas alkaliphila DINO产量最高（0.93 g/L，占细胞干重18%），而阴性菌株无PHA积累。这验证了分子筛查工具与表型结果的一致性。

Characterisation of PHA produced with NMR

通过13C和1H-NMR光谱分析，确认所有阳性菌株生产短链P(3HB)。光谱显示特征峰：1H-NMR中δ=1.25 ppm（甲基基团）、δ=2.5 ppm（亚甲基质子）和δ=5.25 ppm（骨架-CH）；13C-NMR中δ=168 ppm（羰基）、δ=41 ppm（脂肪碳）、δ=67 ppm（氧键碳）和δ=20 ppm（单体单元），证实了PHA的化学结构。

结论与讨论

该研究成功开发并验证了一种高度简并引物为基础的分子工具，能够可靠检测和分类四大类phaC基因。通过 in silico 和 in vitro 验证，工具显示出高特异性和覆盖范围，尤其在海洋环境样本中应用成功。筛查出的新型海洋细菌，如Halomonas和Bacillus物种，证实了其在PHA生产中的潜力，其中Halomonas alkaliphila DINO表现出最优产量。

研究的意义在于解决了现有引物组的不足，提供了一种高效、快速的筛查方法，适用于多样本环境（如海洋和陆地）。工具的成功应用不仅加速了PHA生产菌的发现，还为生物塑料产业的可持续发展提供了技术支持。未来，通过代谢工程优化菌株（如敲除phaZ基因或过表达phaC），有望进一步提高PHA产量和商业化可行性。总之，这项研究为应对塑料污染和推动绿色材料开发提供了重要科学依据。