CRISPR/Cas9靶向编辑番茄SlGAD3基因实现商业化品种中γ-氨基丁酸（GABA）的超高积累

本研究针对番茄中具有降压功能的γ-氨基丁酸（GABA）生物强化需求，通过CRISPR/Cas9技术精准敲除SlGAD3基因的钙调蛋白结合域（CaMBD），在三个优良番茄品种（SFT1、SFT2、SFT3）中实现GABA含量显著提升（最高达6269 μg/g），同时关键农艺性状未受显著影响，为功能性食品开发提供了突破性策略。

随着人们健康意识的提升，功能性食品的开发成为农业与食品科学领域的热点。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid, GABA）作为一种非蛋白质氨基酸，被多项研究证实具有降低血压的生理功能，因此富含GABA的作物品种培育具有重要的健康意义。番茄作为全球广泛消费的蔬菜作物，其果实天然具备积累GABA的能力，但常规品种中的含量仍难以满足功能性食品的需求。此前研究表明，番茄中的谷氨酸脱羧酶3（SlGAD3）在其C末端含有一个钙调蛋白结合域（calmodulin-binding domain, CaMBD），该结构域在缺乏钙离子/钙调蛋白（Ca²⁺/CaM）时会抑制酶活性。通过分子手段破坏这一结构域，有望解除抑制，大幅提升GABA的合成能力。然而，以往研究多集中在模式品种“Micro-Tom”上，该品种虽便于实验室研究，但因植株矮小、代谢特性特殊，并不适合直接推广应用。因此，如何将SlGAD3靶向编辑技术有效应用于优良商业品种，并在提升GABA含量的同时保持品种原有的高产、优质特性，成为实现该技术从实验室走向市场的关键瓶颈。

针对这一挑战，来自南方科技大学、山东舜丰生物科技有限公司及安徽农业大学的联合研究团队在《aBIOTECH》发表了题为“Targeted mutagenesis of SIGAD3 generates very high levels of GABA in commercial tomato cultivars”的研究论文。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对三个优良番茄品种（SFT1、SFT2和SFT3）的SlGAD3基因CaMBD编码区进行精准突变，成功获得了GABA含量显著提高且农艺性状稳定的基因编辑材料。

在研究过程中，作者主要采用了以下几项关键技术方法：首先，针对SlGAD3基因的CaMBD区域设计并构建了CRISPR/Cas9编辑载体，通过农杆菌介导法转化三个番茄商业品种；其次，通过Sanger测序鉴定获得纯合突变且无转基因成分的T1代植株；此外，利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术精准定量番茄果实不同发育阶段的GABA含量；最后，对植株株高、开花时间、单株产量等农艺性状进行了系统评估。所有植物材料均在25℃、16小时光照/8小时黑暗的培养室条件下统一培育。

研究结果主要包括以下几个方面：

Effect of SIGAD3 mutation on the GABA content of tomato fruit

通过序列分析证实，所有突变均导致SlGAD3蛋白提前终止，从而缺失了CaMBD结构域。GABA含量测定结果显示，野生型番茄果实的GABA积累在发育过程中呈现动态变化，于Br+12阶段（ breaker后12天）达到峰值。而在SlGAD3突变体中，GABA含量显著提升：SFT1突变株系的GABA含量达到野生型的3.2至4.4倍，最高值达3269 μg/g；SFT2和SFT3突变株系的GABA含量提升更为显著，部分株系超过6000 μg/g。

Phenotypic analysis of WT and mutant tomato plants

在农艺性状方面，SFT1突变株系的表现尤为突出：其株高、单株产量及开花时间与野生型相比均无显著差异。尽管SFT2和SFT3突变株系出现了开花延迟现象，但株高和果实大小未受明显影响。这表明通过品种选择（如SFT1）可有效规避基因编辑可能带来的多效性影响，实现GABA高效积累与农艺性状的协同改良。

该研究得出结论：利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑SlGAD3基因的CaMBD区域，可显著提高多个商业番茄品种的GABA含量，且通过选择合适的品种背景（如SFT1），能够在不影响开花时间、植株生长和产量的前提下实现目标。这一工作成功将SlGAD3的代谢工程研究成果从模式品种推广至商业品种，填补了实验室研究与作物改良应用之间的关键空白，为培育具有健康功效的番茄新品种提供了可靠的技术路径和种质资源。