副溶血弧菌和霍乱弧菌存活非可培养状态的快速检测与诱导技术及其在海产品安全评估中的应用

本研究针对海产品中副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)和霍乱弧菌(V. cholerae)的存活但非可培养(VBNC)状态漏检问题，开发了基于特异性基因groEL（510 bp）和ompW（588 bp）的vqPCR（viable quantitative PCR）检测方法，结合DNA嵌合染料Reagent D实现活菌精准鉴别，灵敏度达20-30 fg DNA；同时建立1小时内化学诱导VBNC状态的新方案（0.5-1.0% Lutensol A03+0.2 M碳酸铵），成功解决传统培养法假阴性难题，为食源性弧菌风险控制提供关键技术支撑。

　　

海产品因其营养丰富而备受消费者青睐，但同时也是弧菌属细菌污染的高风险载体。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)作为常见的食源性病原体，广泛分布于全球海洋及河口生态系统中，尤其易污染生食或未彻底加热的海产品（如牡蛎、寿司等），引发人类胃肠炎甚至爆发性感染事件。近年来，随着全球海产品消费量增长、水产养殖业集约化发展以及水温上升等因素，弧菌感染病例呈持续上升趋势，对公共卫生安全构成严峻挑战。

传统弧菌检测依赖于ISO 21872-1:2023-06标准推荐的培养法，该方法虽成熟却存在显著局限：当细菌处于存活但非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态时，无法通过平板培养检出。VBNC状态是细菌在低温、营养匮乏等逆境下形成的休眠态，细胞代谢活跃且保持致病性（如表达毒素基因ctx、tdh、trh），但仍可导致感染。因此，开发能精准鉴别VBNC细胞的检测技术对保障海产品安全至关重要。

为突破这一技术瓶颈，来自德国柏林自由大学兽医公共卫生中心的研究团队在《Journal of Food Engineering》发表了一项创新研究，建立了针对副溶血弧菌和霍乱弧菌的vqPCR（viable quantitative PCR）检测体系，并首次实现了弧菌VBNC状态的快速诱导。该研究不仅提升了海产品中弧菌的检出率，更为VBNC细胞的标准化检测提供了可靠方案。

研究采用以下关键技术：

1. 1.

   vqPCR检测体系构建：针对副溶血弧菌groEL基因（510 bp）和霍乱弧菌ompW基因（588 bp）设计引物，结合DNA嵌合染料Reagent D选择性抑制死菌DNA扩增，实现活菌（含VBNC状态）特异性检测；

2. 2.

   VBNC状态快速诱导：参考Robben等人方法，测试17种非离子表面活性剂与3种无机盐组合，最终确定0.5-1.0% Lutensol A03与0.2 M碳酸铵溶液可于1小时内高效诱导VBNC状态；

3. 3.

   多维度验证：通过培养特性（LB平板）、代谢活性（API 20E试剂盒、ATP检测）、膜完整性（LIVE/DEAD BacLight染色）及形态学分析综合确认VBNC细胞；

4. 4.

   实际样本检测：采集德国零售市场的65份虾类和9份贝类样本，并行开展ISO培养法与vqPCR对比检测。

单重vqPCR检测副溶血弧菌与霍乱弧菌的建立

通过系列稀释DNA标准品建立标准曲线，副溶血弧菌groEL基因与霍乱弧菌ompW基因的扩增均呈现优异线性（R²>0.99），灵敏度分别达20 fg（约3.5个细胞）和30 fg（约6.9个细胞）。Reagent D处理可有效抑制死菌DNA扩增，熔解曲线分析显示活菌样本出现单一特异性峰（副溶血弧菌86°C，霍乱弧菌82.5°C），而死菌及阴性对照无扩增信号。

VBNC状态诱导与确认

Lutensol A03与碳酸铵组合处理1小时后，弧菌细胞成功进入VBNC状态：培养平板无生长，但API 20E糖发酵试验显示代谢活性保留，ATP产量（>10,000 RLU）及膜完整性（绿色荧光）均证实细胞存活。形态学观察发现VBNC细胞由杆状变为球状，符合休眠态特征。vqPCR检测诱导后样本显示副溶血弧菌VBNC细胞浓度为6.2 Log₁₀ cells/ml（Ct=29），霍乱弧菌为6.8 Log₁₀ cells/ml（Ct=28）。

海产品样本中活菌检测应用

在38份副溶血弧菌样本和36份霍乱弧菌样本中，vqPCR检出率（53%和58%）显著高于ISO培养法（29%和6%）及TCBS平板计数（5%和3%）。其中50%副溶血弧菌和56%霍乱弧菌阳性样本仅通过vqPCR检出，证明传统方法存在大量假阴性。污染水平分别为2.6-4.2 Log₁₀ cells/g和2.8-5.2 Log₁₀ cells/g，且虾类与贝类样本间无显著差异。

本研究成功建立了高效、特异的vqPCR检测技术，能够精准识别海产品中包括VBNC状态在内的活体弧菌，弥补了传统培养法的缺陷。同时，首创的1小时VBNC诱导方案为弧菌检测方法的标准化与验证提供了稳定可控的阳性参照体系。这两项突破不仅提升了食源性弧菌风险的监控能力，更为全球海产品安全标准修订提供了关键技术依据。未来，该技术有望集成至常规检测流程中，通过与培养法联用显著降低弧菌感染风险，保障公众健康。