高效HPLC-DAD方法的开发与验证及其在红茶加工过程中多酚转化动态分析中的应用

本研究针对茶叶多酚分析中存在的共洗脱、分离效率低及提取方法不统一等问题，开发了一种快速、高效的HPLC-DAD方法，成功实现了12种关键成分（包括儿茶素、茶黄素等）的同时定量分析。该方法展现出优异的线性（r2 > 0.9995）、灵敏度（LOD低至0.03 μg/mL）和精密度（RSD < 4.68%），并优化了超声辅助提取工艺。应用于红茶加工过程监测，揭示了多酚的动态转化规律，为茶叶质量控制、营养标签制定及功能食品研发提供了可靠的分析工具和理论依据。

　　

茶（Camellia sinensis）作为全球广泛消费的饮品，不仅因其独特的风味和文化底蕴备受青睐，更因其富含多种生物活性成分（如多酚类和生物碱）而显示出促进健康的潜力。绿茶中以儿茶素（catechins）类成分为主，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG），赋予了其强大的抗氧化能力。而红茶则经过萎凋、揉捻、发酵（氧化）、干燥等加工过程，在多酚氧化酶（PPO）的作用下，儿茶素发生氧化聚合，形成茶黄素（theaflavins, TFs）等产物，从而造就了红茶特有的色、香、味。这些多酚物质的精确含量和转化动态直接影响茶叶的最终品质和健康功效。

然而，对茶叶中这些关键成分进行准确定量一直面临诸多挑战。首先，现有的高效液相色谱（HPLC）分析方法常常无法有效分离结构相似的化合物，例如儿茶素和茶黄素经常发生共洗脱现象，影响定量的准确性。其次，传统的C₁₈色谱柱分析时间过长，降低了样品通量。虽然超高效液相色谱（UHPLC）能提供更快的分析速度，但其高昂的成本限制了其广泛应用。此外，从复杂的茶叶基质中高效且稳定地提取出所有目标化合物也是一大难题。热水提取或国际标准化组织（ISO）推荐的标准方法往往无法充分提取出所有生物活性物质，特别是极性较低的茶黄素。因此，开发一种快速、高效、成本低廉且能同时精准分析绿茶和红茶中多种关键成分的HPLC方法，并优化其提取工艺，对于茶叶的质量控制、加工工艺优化以及健康功效研究都具有重要意义。

为此，来自新西兰梅西大学（Massey University）食品与先进技术学院的Prishanthini Muthulingam、Ali Rashidinejad等研究人员开展了一项研究，旨在开发并验证一种 robust 的HPLC结合二极管阵列检测器（DAD）的方法，用于同时定量分析茶叶中的12种关键成分，包括：没食子酸（gallic acid）、可可碱（theobromine）、咖啡因（caffeine）、(+)-儿茶素（C）、(-)-表儿茶素（EC）、(-)-表没食子儿茶素（EGC）、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、(-)-表儿茶素没食子酸酯（ECG）、茶黄素（TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（TF3G）、茶黄素-3'-没食子酸酯（TF3'G）和茶黄素-3,3'-双没食子酸酯（TF3–3'G）。研究成果发表在《Journal of Food Composition and Analysis》上。

为达成研究目标，作者团队运用了几个关键技术方法。他们采用了基于Kinetex XB-C₁₈色谱柱（100 × 4.6 mm, 2.6 μm）的HPLC-DAD分析平台，建立了能在40分钟内完成12种化合物分离的梯度洗脱方法。在方法学验证中，全面评估了线性范围、灵敏度（LOD和LOQ）、精密度（日内和日间）和准确度（加标回收率）。在样品前处理方面，系统比较了22种提取方法（包括热水、ISO标准法以及不同浓度甲醇/乙醇溶液的超声辅助提取）的效率，最终确定70%甲醇超声提取为最优方案。研究的样本来源于斯里兰卡萨默塞特茶园（Somerset Tea Estate）的鲜叶，并系统采集了红茶加工过程中多个关键阶段（鲜叶FTL、萎凋叶WTL、揉捻叶ROL、转子揉切叶RTL、氧化叶OTL 1-3、干茶FBT）的样品，用以追踪多酚物质的动态变化规律。

3.1. 茶叶化合物的分离

研究人员成功开发出的HPLC方法能够有效分离和定量分析红茶加工过程中的12种关键化合物。如图2所示，混合标准品、绿茶提取物和红茶提取物的色谱图在210 nm波长下显示出所有分析物分离良好的峰，其保留时间范围从没食子酸的3.75分钟到TF3–3′G的32.50分钟。

3.1.1. 方法验证与性能

验证结果证实该方法稳健可靠，适用于常规茶叶分析。所有标准品的校准曲线在0.9375–150 μg/mL浓度范围内均表现出优异的线性（相关系数r > 0.9995）。方法的灵敏度高，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别低至0.03–1.68 μg/mL和0.01–0.56 μg/mL，优于先前报道的方法。方法的精密度良好，日内和日间相对标准偏差（RSD）分别低于3.59%和4.68%。加标回收率实验表明，在超纯水中回收率为92.64%至100%，在红茶基质中为85.86%至99.16%，表明方法准确可靠，尽管TF3–3′G在红茶基质中的回收率相对较低（85.86%），这可能是由于基质效应所致。

3.1.2. 与既往发表方法的比较

研究人员将本研究建立的HPLC方法与之前报道的几种方法进行了详细比较。比较的参数包括分析化合物数量、运行时间、检测限（LOD）、日间精密度（RSD）、线性（r2）和回收率。尽管本研究同时分析的化合物数量（12种）并非最多，但其实现了最短的分析运行时间（40分钟），这主要归功于使用了粒径更小（2.6 μm）的Kinetex XB-C₁₈色谱柱，其提高了色谱分离度和分析效率。综合来看，本研究建立的方法在分析速度、线性、精密度和整体性能上表现优异，非常适合于茶叶多酚的高通量、靶向分析。

3.2. 提取方法的优化

通过对22种不同提取方法（包括热水、水/乙醇/甲醇溶液的超声提取以及ISO标准方法）的系统评估，研究发现超声辅助提取，特别是使用70%甲醇（U_M70）的方法，在从绿茶和红茶中提取多酚类化合物方面表现最优。聚类热图和主成分分析（PCA）结果清晰地显示，绿茶方法因儿茶素含量高而聚集在一起，而红茶方法则因茶黄素和咖啡因含量高而形成另一簇。甲醇和乙醇（浓度50–70%）的超声提取效果优于热水和ISO标准方法， likely due to enhanced solvent penetration and cavitation，但在90%的高溶剂浓度下提取效率下降，表明可能存在降解或提取不充分。

3.3. 红茶加工过程中主要多酚的动态变化

本研究详细量化了红茶加工过程中12种关键化合物的动态变化。

3.3.1. 多酚动态学

总儿茶素含量从鲜叶（FTL）中的328.36 mg/g急剧下降至干茶（FBT）中的70.33 mg/g，降幅高达78.5%，其中EGCG的下降最为显著（98.2%）。这一变化主要归因于揉捻和氧化阶段多酚氧化酶（PPO）催化的氧化反应，儿茶素被转化为茶黄素和茶红素（thearubigins）。萎凋过程使儿茶素减少了44.6%，揉捻进一步减少了27.8%。与之相反，茶黄素在鲜叶中未检出（低于LOD），在萎凋阶段开始出现（12.40 mg/g），并在揉捻后达到峰值（15.97 mg/g），但在后续的氧化过程中因可能转化为茶红素而下降24.2%，最终在干燥阶段稳定在10.98 mg/g左右。没食子酸含量总体下降了67.7%，但在揉捻阶段观察到暂时性升高（37.7%），这可能是酯酶介导的没食子酰化儿茶素水解的结果。可可碱减少了30.3%，咖啡因相对稳定，仅减少了5.93%，这主要反映了加工过程中的物理损失（如浸出）。总酚含量（TPC）下降了55.0%，整体变化趋势与儿茶素一致。

3.3.2. 相关性与聚类分析

皮尔逊相关性分析揭示了化合物之间的强关联性：儿茶素内部呈高度正相关（0.81–0.98），茶黄素内部也呈正相关（0.58–0.89）。然而，儿茶素与茶黄素之间普遍呈负相关关系（-0.47–0.15），这直观地反映了儿茶素氧化转化为茶黄素的生化过程。层次聚类分析将化合物分为两个主要簇：第一个簇包含儿茶素、没食子酸和可可碱，其在加工前期（FTL, WTL）含量丰富，随后逐渐减少；第二个簇包含所有茶黄素，其在加工后期（ROL之后）出现并含量增加。对加工阶段的聚类则将FTL和WTL归为一组，ROL和RTL归为一组，OTL1-3和FBT归为一组，清晰地勾勒出加工过程中化学成分变化的阶段性特征。

本研究成功开发并验证了一种高效、可靠的HPLC-DAD方法，用于同时定量分析茶叶中的12种关键多酚和生物碱成分。该方法在线性、灵敏度、精密度和准确度方面均表现出色，分析时间短，优于许多现有方法。研究同时优化了提取工艺，确定70%甲醇超声提取为最佳方案。通过应用该方法追踪红茶加工全过程，研究人员详细揭示了儿茶素大幅减少、茶黄素先增后减以及其他成分的动态变化规律，这些变化主要受酶促氧化、浸出效应和品种特性的影响。

该研究的结论具有多重重要意义。首先，所建立的HPLC-DAD方法为茶叶（乃至其他多酚丰富的体系）的多酚分析提供了一个强大、实用的工具，可用于精准的质量控制、真实的营养标签制定以及深入的功能食品研究。其次，对加工过程中多酚转化规律的深入理解，为优化红茶加工工艺、定向调控茶叶品质和最大化其健康益处提供了科学依据。例如，通过监控关键阶段（如揉捻和氧化）的化学变化，生产者可以更好地控制最终产品的风味和功能特性。总之，这项工作不仅推进了茶叶分析化学的技术水平，也为茶叶产业的提质增效和创新发展奠定了坚实的基础。