黑色素驱动延迟性环丁烷嘧啶二聚体形成不依赖黑色素生物合成通路

本研究针对紫外线诱导DNA损伤中延迟性环丁烷嘧啶二聚体（dCPD）的形成机制，通过建立去色素化-再色素化模型，发现黑色素的存在（而非生物合成过程）是dCPD形成的关键决定因素。研究人员证实5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）的非酶促聚合即可恢复dCPD形成能力，并揭示一氧化氮合酶（NOS）活性的关键作用。该发现革新了对黑色素光生物学功能的理解，对皮肤癌风险评估具有重要启示意义。

　　

紫外线辐射是导致皮肤癌的主要环境因素，其中环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs）是最主要的DNA损伤形式。传统观点认为CPDs仅在紫外线照射过程中瞬时形成，但近年研究发现，在照射结束后数小时内仍会持续产生"延迟性CPDs（delayed CPDs, dCPDs）"，这种损伤可占总CPD负荷的50%。更令人惊讶的是，这一过程与黑色素密切相关——紫外线诱导的过氧亚硝酸盐（peroxynitrite）能够氧化黑色素形成激发态中间体，进而通过能量转移导致DNA损伤。

然而，一个关键问题尚未解决：dCPD的形成究竟需要活跃的黑色素生物合成过程，还是仅仅依赖于色素的存在？这个问题对于理解色素相关皮肤癌的发病机制具有重要意义。为了解决这一科学问题，由Vipin K. Yadav、Jyoti Srivastava等研究人员组成的团队开展了一项深入研究，其研究成果发表在《Journal of Investigative Dermatology》上。

研究人员主要运用了去色素化-再色素化细胞模型系统、分光光度法黑色素定量、CPD酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光染色、免疫组织化学以及一氧化氮合酶（NOS）抑制实验等关键技术方法。实验中使用的Mel-a和Mel-c黑色素细胞系来自耶鲁大学医学院的材料转移协议，人源化小鼠皮肤样本则来自具有不同色素基因型的转基因小鼠模型。

De-pigmentation abolishes, and re-pigmentation restores, dCPD formation in Mel-a cells

研究人员首先建立了可逆的色素调控系统。将Mel-a细胞在酪氨酸缺乏培养基（Tyr(-) medium）中培养3-4周实现去色素化，这些细胞变得圆润，树突状结构消失，黑色素颗粒减少。通过重新引入不同浓度的酪氨酸培养基（2%-100% Tyr(+)），细胞逐渐恢复典型的黑色素细胞形态，黑色素含量呈剂量和时间依赖性增加。功能实验显示，完全色素化的细胞在100 kJ/m² UVA照射后表现出强劲的dCPD形成能力，而去色素化细胞则完全缺乏dCPD形成，尽管它们仍能产生即时CPDs（iCPDs）。酪氨酸剂量依赖性的dCPD恢复与色素积累密切相关，证实色素含量与dCPD形成能力直接相关。

DHICA-mediated re-pigmentation restores dCPD formation, underscoring the importance of melanin synthesis

为了区分黑色素存在与生物合成过程的作用，研究人员使用5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）——一种能够非酶促聚合为真黑素（eumelanin）的黑色素单体。在酪氨酸缺乏条件下，DHICA处理使去色素化Mel-a细胞逐渐恢复色素沉着和树突状形态。分光光度分析证实细胞内黑色素含量随DHICA浓度增加而升高，更重要的是，dCPD形成能力也得到恢复，且呈剂量依赖性。这一发现表明，即使绕过酶促黑色素合成途径，仅通过色素存在就足以恢复dCPD形成能力。

DHICA-induced re-pigmentation in Mel-c cells restores dCPD formation

为了进一步验证这一结论，研究人员使用了Mel-c细胞——一种与Mel-a细胞同源但携带酪氨酸酶功能缺失突变的白化细胞系。这些细胞即使在酪氨酸充足的培养基中也无法产生黑色素。然而，当用DHICA处理时，Mel-c细胞表现出剂量依赖性的色素沉着和dCPD形成能力恢复，尽管形态学恢复不如Mel-a细胞明显。这一结果明确证明：黑色素的存在本身，而非生物合成过程的活性，是dCPD形成的关键决定因素。

Re-pigmentation with Tyrosine or DHICA Activates NOS: A Preliminary Mechanistic Insight

机制研究表明，色素积累与一氧化氮合酶（NOS）活性相关。硝基酪氨酸（nitrotyrosine）作为过氧亚硝酸盐生成的生物标志物，在再色素化细胞中呈现剂量依赖性增加。无论是通过酪氨酸酶促途径还是DHICA非酶促途径实现的色素沉着，都能激活NOS通路，但酶促途径诱导的NOS激活更强。功能实验显示，NOS抑制剂能够完全消除DHICA色素化Mel-c细胞中的dCPD形成，证实 nitric oxide信号在黑色素介导的化学激发中的必要性。

Nitrotyrosine accumulation in vivo is highest in eumelanin-rich skin

体内研究进一步支持了这些发现。通过对人源化小鼠皮肤进行免疫组织化学分析，发现真黑素丰富的皮肤表现出强烈的硝基酪氨酸染色，而白化皮肤仅显示微弱信号。这种差异不能归因于黑色素色素干扰，因为同样色素沉着的培养黑色素细胞在没有过氧亚硝酸盐供体处理的情况下缺乏可检测的硝基酪氨酸信号。

研究结论表明，细胞内黑色素含量本身，而非持续的黑色素生成过程，足以介导黑色素细胞中dCPD的形成。这一发现挑战了黑色素纯粹具有光保护作用的传统观点，揭示了其在维持 prolonged genotoxic stress中的双重作用。虽然黑色素的抗氧化特性有助于降低深色皮肤个体的皮肤癌发病率，但其维持 prolonged genotoxic stress的能力突出了其在皮肤健康中背景依赖性的作用。

这项研究的意义在于为个性化光保护策略提供了科学依据，这些策略应保留黑色素的保护作用同时减轻延迟性DNA损伤。针对黑色素驱动化学激发通路的干预措施可能减少紫外线诱导的基因毒性，同时保留色素沉着的益处。未来开发色素相关基因毒性应激和化学激发抑制剂的生物标志物将对针对不同色素谱的精准方法至关重要，从而最大限度地减少恶性和非恶性色素相关皮肤病变。

该研究不仅深化了我们对紫外线诱导DNA损伤机制的理解，还为开发新型皮肤保护策略提供了重要的理论基础。值得注意的是，黑色素这种"双刃剑"特性——既保护又伤害——提醒我们需要更加全面地评估色素沉着在皮肤健康中的作用，而不是简单地将其归类为保护性或有害因素。